Filamin A mediated epithelial-mesenchymal transition during embryonic palate development

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本研究の目的である、口蓋突起癒合部におけるFillamin A (Flna)の発現が口蓋の発生に与える影響を調べるため、本年度は主に以下の３項目の研究を実施した。①器官培養実験：我々がこれまでに確立してきた、マウス胎児口蓋の器官培養法を用いて、口蓋突起部上皮消失の重要な因子であるTGF-βとFlnaとの関係を検討した。具体的にはTGF-β阻害薬およびTGF-βの下流で活性化するRhoA阻害薬、さらに、siRNAを用いたFlnaのノックダウンを行い、器官培養中の口蓋でどのような反応が生じるかを観察した。この結果、TGF-β阻害薬およびRhoA阻害薬を添加した培養液を用いたマウス胎児口蓋では、Flnaタンパクの産生が著しく低下していた。これらのことからFlnaは既報のTGF-βやRhoAシグナルの下流で働いていることが示唆された。②In vitro実験：器官培養法で得られた上記の結果をより詳細に調べるため、ヒト表皮角化細胞であるHaCat細胞を用いてTGF-β経路下流で発現するFlnaと上皮間葉転換について検討した。この結果の解釈に関しては追加で実験を行う必要があると考えられる。③遺伝子改変マウスの作成：上皮細胞特異的にFlnaをノックダウンさせるため、KRT14-CreマウスとFlna floxマウスをどちらもJackson Laboratoryから購入した。凍結胚からそれぞれの遺伝子改変マウスを作出し、現在交配を続けている。現段階で交配に問題は認められず、約3か月程度で目的のマウスが得られる予定である。また、上記項目以外に、Nanostring社のGeoMXを用いた空間的トランスクリプトーム解析を行うための準備実験を行なった。具体的には、胎生14日マウス胎児口蓋のパラフィン切片を作成し、パラフィン切片でも検出できるFlna抗体の選定を行なった。