Simplifying complexity and diversity of circadian clocks

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野生型KaiC、単一リン酸化型KaiC変異体、現生型KaiCホモログ、祖先型KaiCを対象としたクライオ電子顕微鏡による単粒子解析およびX線結晶構造解析に着手した。野生型KaiC、単一リン酸化型KaiC変異体の溶液条件（緩衝液、濃度等）の最適化、グリッド凍結条件の検討により電子顕微鏡像を取得し、新規なKaiC六量体の構造多型を検出した。現生型KaiCホモログ、祖先型KaiCを対象とした広範囲の結晶化剤探索の末、新規な結晶化条件を見出した。KaiCに結合したヌクレオチドの種類を特定し、それらの量を正確に決定するための手法開発を行った。一連の改良により、各種ヌクレオチド(ADPやATPなど)の識別・検出感度が飛躍的に向上し、各種ヌクレオチドの寿命の温度依存性や、変異導入に伴う寿命変化を定量的に議論できるようになった。概日時計の同調機能とKaiCのATPase活性との関連を明らかにするため、温度刺激に対するATPase活性リズムの応答を調べた。ATPase活性リズムの高精度測定中に温度を急激に変化させる独自の技術を用いることで、KaiCのATPase活性が温度変化後、位相応答曲線と相関して直ちに変化することを発見した。一方、KaiCのリン酸化状態は温度変化後すぐには変化しないことから、ATPase活性の急激な変化が位相変化を引き起こす可能性を見出した。蛋白質ダイナミクスのより詳細な特徴づけを可能とする中性子準弾性散乱スペクトルの新しい解析法を検討した。また、今後の構造解析で重水素化KaiCを利用する可能性に鑑み、安定的な蛋白質重水素化法を確立した。これらの手法は今後の測定・解析の基盤となる。