膜結合型酵素の可溶性酵素化とプラズマローゲンライブラリー構築への応用

微生物およびヒトPEDSのN末端側にMBPを、C末端側にApoAIを付加した発現プラスミドを構築し、融合タンパク質として大腸菌で発現を試みた。微生物PEDSは低温での発現誘導により細胞内に可溶性タンパクとして発現し、細胞破砕液の遠心分離上清から回収することができた。さらに回収した微生物PEDSをニッケルNTAアガロースにより精製できた。精製したPEDSのCDスペクトル測定の結果、本タンパクは一定の立体構造をとっていることが予想された。一方、ヒトPEDSのMBP-ApoAIとの融合タンパクは可溶性はおろか、不溶性タンパク質としても発現しなかった。抗MBP抗体を用いたウエスタンブロットの解析から、このヒトPEDS融合タンパクはN末端に付加したMBPまでは翻訳されるが、PEDS部分の途中で翻訳が停止していることが予想された。ヒトPEDSはそのN末部分が微生物PEDSと比較して長い。そこで、ヒトPEDSのN末端27アミノ酸残基を微生物PEDSの9アミノ酸残基に置き換えたキメラ遺伝子を作成し、前述のMBP/ApoAIとの融合フォーマットで発現させたところ、可溶性タンパクとして発現させることに成功した。可溶性タンパクとして発現させた微生物およびヒトPEDSを用いて、プラスマローゲン合成を試みた。本酵素は電子伝達体としてシトクロムB5(Cb5)と同還元酵素(B5R)を必要とする。別途可溶性タンパクとして発現調製したCb5とB5Rの存在下、有機合成したアルキルアシルリン脂質を基質として酵素反応をおこなったが、プラズマローゲンの合成は確認できなかった。さらにPEDS融合タンパクのN末端部分に付加したMBPをCb5と置き換えた発現プラスミドを新たに構築し、可溶性タンパクとして発現させることに成功したが、この酵素の活性も検出することはできなかった。

微生物およびヒトPEDSのN末端側にMBPを、C末端側にApoAIを付加した発現プラスミドを構築し、融合タンパク質として大腸菌で発現を試みた。微生物PEDSは低温での発現誘導により細胞内に可溶性タンパクとして発現し、細胞破砕液の遠心分離上清から回収することができた。さらに回収した微生物PEDSをニッケルNTAアガロースにより精製できた。精製したPEDSのCDスペクトル測定の結果、本タンパクは一定の立体構造をとっていることが予想された。一方、ヒトPEDSのMBP-ApoAIとの融合タンパクは可溶性はおろか、不溶性タンパク質としても発現しなかった。抗MBP抗体を用いたウエスタンブロットの解析から、このヒトPEDS融合タンパクはN末端に付加したMBPまでは翻訳されるが、PEDS部分の途中で翻訳が停止していることが予想された。ヒトPEDSはそのN末部分が微生物PEDSと比較して長い。そこで、ヒトPEDSのN末端27アミノ酸残基を微生物PEDSの9アミノ酸残基に置き換えたキメラ遺伝子を作成し、前述のMBP/ApoAIとの融合フォーマットで発現させたところ、可溶性タンパクとして発現させることに成功した。可溶性タンパクとして発現させた微生物およびヒトPEDSを用いて、プラスマローゲン合成を試みた。本酵素は電子伝達体としてシトクロムB5(Cb5)と同還元酵素(B5R)を必要とする。別途可溶性タンパクとして発現調製したCb5とB5Rの存在下、有機合成したアルキルアシルリン脂質を基質として酵素反応をおこなったが、プラズマローゲンの合成は確認できなかった。さらにPEDS融合タンパクのN末端部分に付加したMBPをCb5と置き換えた発現プラスミドを新たに構築し、可溶性タンパクとして発現させることに成功したが、この酵素の活性も検出することはできなかった。