Development of FISH probes by microsatellite sequences to visualize the reticulate evolution of Acropora corals.

2022年度は，夏季のミドリイシ属サンゴの産卵時期（例年7月～9月の下弦前後）の天候不順により，クシハダミドリイシ等の一部の種については試料収集が可能であったものの，交雑実験の実施のために十分な試料を得ることはできなかった。マイクロサテライト領域のFISH（蛍光in situハイブリダイゼーション）分析用プローブの開発について，上記のとおり胚試料が採取できたこと，全ゲノム配列情報が公的データベースに登録されていることなどから，クシハダミドリイシに焦点を絞り，”Tandem Repeats Finder”プログラムを用いて，繰り返し配列の網羅的分析を実施して繰り返し配列のリストを作成した。その結果，全205種の繰り返し配列が検出された。コピー数については，そのうち187種の配列について，500以下であることが分かったが，1500～2000コピー存在するものも2種存在した。また，繰り返し配列長については，500 bp長まで万遍なく分布していた。FISH分析では一般的に，1,000 bp以下のサイズのプローブではたとえゲノムDNAとの配列の類似性が高くてもシグナルが弱く，対象物の検出が困難である。そこで，FISHプローブ開発の候補として，繰り返し数と繰り返し配列長の積を計算し，その分布を確認した。その結果，10,000～15,000 bpのサイズのものが118種，15,000～20,000 bpのものが44種，20,000～25,000 bpのものが23種と，FISHプローブとしては十分な長さを有していることが判明した。ここで得られた配列については，繰り返し配列の外側の配列（繰り返しでない）が判明しているため，その部分でPCRプライマーを設計し，FISHプローブを作成するとともに，繰り返し配列部分について，約30 bpの合成ヌクレオチドに蛍光標識をしたものも作成してFISH分析を行なった。しかしながら，どのプローブについてもシグナルを検出することができなかった。

2022年度は，夏季のミドリイシ属サンゴの産卵時期（例年7月～9月の下弦前後）の天候不順により，クシハダミドリイシ等の一部の種については試料収集が可能であったものの，交雑実験の実施のために十分な試料を得ることはできなかった。マイクロサテライト領域のFISH（蛍光in situハイブリダイゼーション）分析用プローブの開発について，上記のとおり胚試料が採取できたこと，全ゲノム配列情報が公的データベースに登録されていることなどから，クシハダミドリイシに焦点を絞り，”Tandem Repeats Finder”プログラムを用いて，繰り返し配列の網羅的分析を実施して繰り返し配列のリストを作成した。その結果，全205種の繰り返し配列が検出された。コピー数については，そのうち187種の配列について，500以下であることが分かったが，1500～2000コピー存在するものも2種存在した。また，繰り返し配列長については，500 bp長まで万遍なく分布していた。FISH分析では一般的に，1,000 bp以下のサイズのプローブではたとえゲノムDNAとの配列の類似性が高くてもシグナルが弱く，対象物の検出が困難である。そこで，FISHプローブ開発の候補として，繰り返し数と繰り返し配列長の積を計算し，その分布を確認した。その結果，10,000～15,000 bpのサイズのものが118種，15,000～20,000 bpのものが44種，20,000～25,000 bpのものが23種と，FISHプローブとしては十分な長さを有していることが判明した。ここで得られた配列については，繰り返し配列の外側の配列（繰り返しでない）が判明しているため，その部分でPCRプライマーを設計し，FISHプローブを作成するとともに，繰り返し配列部分について，約30 bpの合成ヌクレオチドに蛍光標識をしたものも作成してFISH分析を行なった。しかしながら，どのプローブについてもシグナルを検出することができなかった。