イバラキウイルス感染における相補現象の分子基盤とウイルス生存戦略

本年度はまず、先行研究で観察された赤色蛍光タンパク質mCherry遺伝子を挿入したイバラキウイルス（IBAV）をハムスター腎臓由来細胞（BSR細胞）で継代すると生じる欠失パターンについて解析を進めた。先行研究では、RT-PCR産物をクローニングして解析を行なっていたため、プライマーが結合する領域が変異した株を解析することができなかった。また、RNAを細胞から抽出したため、ウイルス粒子中に取り込まれたRNAであるかは不明であった。そこで、感染細胞だけでなくその培養上清中からもRNAを抽出し、現在MiSeqで解析中である。また、mCherry遺伝子の欠失が起こる機序を解明するため、先行研究で得られた欠失パターンをもとにRNA二次構造を解析し、IBAV RdRpが読み飛ばしてしまう異常な対合の探索を開始した。さらに、各継代ウイルス集団の増殖性を細胞変性効果（CPE）とmCherryの蛍光に基づくフォーカスで解析したところ、CPEから算出されるウイルス力価がフォーカスから算出される力価を上回る前には欠失によって複製能を失ったIBAVが大量に生じることを示唆するデータを得た。次に野生型IBAVと緑色蛍光タンパク質eGFP遺伝子、もしくはUnaG遺伝子を挿入したIBAVをシマカ由来細胞（C6/36細胞）で継代した。UnaG遺伝子を挿入したIBAVはC6/36細胞でウイルスゲノム複製およびタンパク質合成は行われたがUnaGの蛍光を観察することができず、ビリルビン結合タンパク質であるUnaGは昆虫細胞でのIBAV感染の可視化には不適であることが明らかとなった。野生型もしくはeGFP遺伝子挿入IBAVは継代が進むとC6/36細胞によりCPEを起こすようになった。現在、増殖性ならびにRNA組成の解析に向けて準備中である。また、IBAVの特性をより理解するため、同属のウイルスの解析も試みた。

本年度はまず、先行研究で観察された赤色蛍光タンパク質mCherry遺伝子を挿入したイバラキウイルス（IBAV）をハムスター腎臓由来細胞（BSR細胞）で継代すると生じる欠失パターンについて解析を進めた。先行研究では、RT-PCR産物をクローニングして解析を行なっていたため、プライマーが結合する領域が変異した株を解析することができなかった。また、RNAを細胞から抽出したため、ウイルス粒子中に取り込まれたRNAであるかは不明であった。そこで、感染細胞だけでなくその培養上清中からもRNAを抽出し、現在MiSeqで解析中である。また、mCherry遺伝子の欠失が起こる機序を解明するため、先行研究で得られた欠失パターンをもとにRNA二次構造を解析し、IBAV RdRpが読み飛ばしてしまう異常な対合の探索を開始した。さらに、各継代ウイルス集団の増殖性を細胞変性効果（CPE）とmCherryの蛍光に基づくフォーカスで解析したところ、CPEから算出されるウイルス力価がフォーカスから算出される力価を上回る前には欠失によって複製能を失ったIBAVが大量に生じることを示唆するデータを得た。次に野生型IBAVと緑色蛍光タンパク質eGFP遺伝子、もしくはUnaG遺伝子を挿入したIBAVをシマカ由来細胞（C6/36細胞）で継代した。UnaG遺伝子を挿入したIBAVはC6/36細胞でウイルスゲノム複製およびタンパク質合成は行われたがUnaGの蛍光を観察することができず、ビリルビン結合タンパク質であるUnaGは昆虫細胞でのIBAV感染の可視化には不適であることが明らかとなった。野生型もしくはeGFP遺伝子挿入IBAVは継代が進むとC6/36細胞によりCPEを起こすようになった。現在、増殖性ならびにRNA組成の解析に向けて準備中である。また、IBAVの特性をより理解するため、同属のウイルスの解析も試みた。