Analysis of the molecular mechanism of reduction of protein secretion in peptide:N-glycanase deficient cells

肽:N-聚糖酶缺陷细胞蛋白质分泌减少的分子机制分析

• 批准号: 22K06155
• 负责人: 平山 弘人
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Institute of Physical and Chemical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K06155/
• 关键词: NGLY1; PNGase; 細胞内輸送; 糖鎖修飾; 糖鎖代謝; 小胞体; 細胞質; glycoprotein; secretory protein; ER stress

細胞質ペプチド:N-グリカーゼ(PNGase，哺乳動物ではNGLY1)は糖タンパク質からN-結合型糖鎖を脱離する反応を触媒するアミダーゼであり，真核生物に広く保存されていることが知られている 。新生糖タンパク質は小胞体内腔で正しく折り畳まれた後に，そのタンパク質が機能を発揮する場所へと輸送される。一方，新たに合成された糖タンパク質のうち，正しい折りたたみ構造をとることが出来なかった異常糖タンパク質は小胞体品質管理機構(ERQC)によって選別され，細胞質へと逆行輸送された後に，ユビキチンープロテアソームによって分解される。小胞体関連分解(ERAD)と呼ばれるこの経路の中で細胞質PNGaseはかさ高く表面積のの大きいN-結合型糖鎖をタンパク質から脱離することによって，筒状構造をとっているプロテアソームにおけるタンパク質の分解効率を向上させていると考えられている。我々はNGLY1欠損HeLa細胞(NGLY1-KO細胞)で細胞外への分泌が減少しているタンパク質を複数見出し，その中でwntシグナルの調節に関わるタンパク質DKK1に着目し，解析を進めている。現在までに，DKK1の発現減少は遺伝子転写レベルではみられないことを確認している。このことから，本タンパク質は翻訳後，なんらかの理由で細胞外への分泌が減少していることが予想された。そこで我々は，FLAGタグを付加したDKK1をHeLa細胞に発現させてその細胞外への分泌異常のメカニズムを詳細に解析することとした。その結果，分泌異常だけでなく，細胞外へと分泌されたFLAG-DKK1はNGLY1-KO細胞由来の野生株のものと比べると，若干の分子量増加が見られた。そこで，この分子量変化に着目しそのメカニズムを明らかにするための解析を実施している。

Cytoplasmic selection: N-glucuronidase (PNGase, Mammalian NGLY1) is a cytosolic selection of N-linked glycosyllocases, which is a catalyst for the release of N-linked glycosyllocases. Eukaryotic organisms are preserved in this way. The newly formed sugar can be transported to the inner cavity of the small cell after being folded, and the function of the new sugar can be developed. On the one hand, the new synthesis of sugar is the first step in the process of quality control. The structure of sugar is the first step in the process of quality control. The quality control of small cells (ERQC) is the first step in the process of quality control. The cytoplasmic retrograde transport is the second step in the process of quality control. In the middle of the small cell-associated decomposition (ERAD) and signaling pathway, cytoplasmic PNGase detaches from the large N-binding sugar chains with high surface area, and the efficiency of protein decomposition increases due to the cylindrical structure. In NGLY1 deficient HeLa cells (NGLY1-KO cells), extracellular secretion was reduced, and the protein DKK1 was analyzed. Now, DKK1 is showing a decrease in the number of entries in the list. The reason for this is that the secretion of extracellular protein is reduced. In addition, we analyzed the changes in DKK1 and its extracellular secretions in detail. As a result, the secretion of FLAG-DKK1 was abnormal, and the extracellular secretion of FLAG-DKK1 was abnormal. Some molecular weight increases were observed in NGLY1-KO cells. The molecular weight of the compound is determined by the molecular weight of the compound.