Analyses on RhoA-induced intracellular calcium signaling using optogenetics
利用光遗传学分析 RhoA 诱导的细胞内钙信号传导
基本信息
- 批准号:22K06219
- 负责人:
- 金额:$ 2.66万
- 依托单位:
- 依托单位国家:日本
- 项目类别:Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
- 财政年份:2022
- 资助国家:日本
- 起止时间:2022-04-01 至 2025-03-31
- 项目状态:未结题
- 来源:
- 关键词:
项目摘要
RhoおよびRasファミリーの低分子量Gタンパク質と細胞内カルシウムシグナルは協調的に細胞骨格や細胞増殖・細胞分化などを制御している。最近、我々は光遺伝学的手法によってRhoAが細胞内カルシウムシグナルを活性化することを示したが、その詳細な分子機序や、空間的制御について不明な点が多く残されていた。本研究では、光遺伝学の長所である高い特異性と時空間分解能によってRhoAの活性を操作し、細胞内カルシウムの挙動や下流分子の変化を観察し、その時空間的な制御機構を明らかにすることを目的とした。本年度は、RhoAがPLCεを活性化する制御機構を明らかとするため、その結合部位の決定を目指した。光照射によってクラスター化をするCRY2clustを持ち、相互作用をライブイメージングで検出できる系を立ち上げた。CRY2clustに恒常活性型のRhoAおよびEGFPを融合したタンパク質と、PLCεの断片をmCherryと融合したタンパク質を、HEK293T細胞に同時に遺伝子導入し、光照射時にRhoA-EGFP-CRY2clustと共にクラスター化をする断片を探索した。しかし、明確にクラスター化する断片はなかった。また、最近、上皮細胞において細胞ー細胞間結合領域において細胞内Ca2+濃度の一過性の上昇がRhoAを活性化するという報告があった。そこで、これが上皮細胞以外においても普遍的にみられる現象であるかをRPE-1細胞を用いて検証することとした。この目的のため、Ca2+特異的な光遺伝学ツールであるhBACCS2およびDmBACCS2のTet-On RPE-1細胞株を樹立した。これらの細胞株は、Doxocyclineによる誘導発現時に青色光の照射によって細胞内Ca2+濃度を上昇させることができた。
Rho Ras is a low molecular weight protein that regulates cell proliferation and differentiation. Recently, we have demonstrated the detailed molecular mechanism of RhoA activation in intracellular cells by using optical genetics, and the control of space. The aim of this study is to investigate the high specificity, temporal and spatial decomposition of RhoA activity, intracellular dynamics, and downstream molecular transformation of RhoA in light and light. This year, RhoA PLC activation control mechanism is clearly defined, and the determination of binding sites is directed. Light irradiation is the key to CRY2clust, interaction is the key to CRY2clust, interaction is the key to CRY2clust. CRY2clust is the fusion of RhoA and EGFP with constant activity, and the fragment of PLC is the mCherry fusion, and the fragment of RhoA-EGFP-CRY2clust is the exploration of the fragment of RhoA-EGFP-CRY2clust co-fusion when irradiated with light. It is clear that there is no way to change the situation. Recently, a transient increase in intracellular Ca2 + concentration in epithelial cells was reported in the cell-to-cell binding domain, resulting in RhoA activation. This is a common phenomenon in RPE-1 cells. For this purpose, Ca2 +-specific Tet-On RPE-1 cell lines were established. The cell lines were induced by Doxocycline, and the intracellular Ca2 + concentration was increased by irradiation with cyan light.
项目成果
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专著数量(0)
科研奖励数量(0)
会议论文数量(0)
专利数量(0)
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