松果体の光受容に関する神経行動学的研究

松果体に主要に存在する6種類のオプシンの内、3種類については、当該遺伝子のみをノックアウトした（シングルKO）ゼブラフィッシュ系統で、松果体の神経細胞で生じる光応答に野生型と異なるパターンが観察されており、3種の変異体の表現型は特定済みである。残りの3種類の内、2種類(LWS-opsin1/2)はノックアウト系統(i)が作製が滞っており、1種については変異体を作製したものの、野生型との顕著な差は観察されていない。そこで、2022年度は松果体オプシンノックアウト系統(i)を作製した。具体的にはCRISPR/Cas9によるゲノム編集により欠損させた個体を作製した。LWS-opsin1および2遺伝子は同一染色体上に存在する遺伝子重複により生じたもので、二つの塩基配列は酷似しているため、LWS-opsin1および2に対して同一の配列でgRNAを作製し、Cas9 mRNAとともにマイクロインジェクションすることでに2遺伝子を同時破壊した。一方で、酷似した塩基配列に伴い、PCRによる遺伝子型判定(genotyping)が通常のプロトコルでは困難であったため、複数のプライマーを用いるPCRによるgenotypingを最適化し、現在運用しており、新規に1系統（LWS-opsin1/2 KO系統）を得た。また予備的に、カルシウムイメージングにより、光応答に異常が生じることを確認した。さらに、既存の松果体オプシンKO個体との交配を繰り返し、6つの松果体オプシンが欠損した、松果体の光感受性が顕著に低下した系統（6-null 系統）を作製した。また、今後、上記のシングルKOによって表現型が得られていないものについて検討するために、当該遺伝子のみがKOされていない系統（部分変異体）を得ることが期待できる集団を飼育中である。

松果体に主要に存在する6種類のオプシンの内、3種類については、当該遺伝子のみをノックアウトした（シングルKO）ゼブラフィッシュ系統で、松果体の神経細胞で生じる光応答に野生型と異なるパターンが観察されており、3種の変異体の表現型は特定済みである。残りの3種類の内、2種類(LWS-opsin1/2)はノックアウト系統(i)が作製が滞っており、1種については変異体を作製したものの、野生型との顕著な差は観察されていない。そこで、2022年度は松果体オプシンノックアウト系統(i)を作製した。具体的にはCRISPR/Cas9によるゲノム編集により欠損させた個体を作製した。LWS-opsin1および2遺伝子は同一染色体上に存在する遺伝子重複により生じたもので、二つの塩基配列は酷似しているため、LWS-opsin1および2に対して同一の配列でgRNAを作製し、Cas9 mRNAとともにマイクロインジェクションすることでに2遺伝子を同時破壊した。一方で、酷似した塩基配列に伴い、PCRによる遺伝子型判定(genotyping)が通常のプロトコルでは困難であったため、複数のプライマーを用いるPCRによるgenotypingを最適化し、現在運用しており、新規に1系統（LWS-opsin1/2 KO系統）を得た。また予備的に、カルシウムイメージングにより、光応答に異常が生じることを確認した。さらに、既存の松果体オプシンKO個体との交配を繰り返し、6つの松果体オプシンが欠損した、松果体の光感受性が顕著に低下した系統（6-null 系統）を作製した。また、今後、上記のシングルKOによって表現型が得られていないものについて検討するために、当該遺伝子のみがKOされていない系統（部分変異体）を得ることが期待できる集団を飼育中である。