光学的膜電位プローブとランダムスキャン2光子顕微鏡による局所神経回路読み出し

電位依存性センサーを用いた膜電位イメージングは局所神経回路の機能的結合の解析に適するが技術的なハードルがあった。音響光学偏光器(AOD)によるXYスキャンを採用し高速に多点を計測できるランダムスキャン型2光子顕微鏡を開発し複数培養神経細胞からの同時多点活動電位計測に成功し、さらに脳スライスを用いて新世代タンパク質型膜電位センサー（GEVI)を用い大脳皮質の発達にともなう神経結合の変化を見出した実績をベースとして、本年度は脳の局所神経回路の理解を進めることを目的とし、小脳切片における複数顆粒細胞からの同時膜電位記録を試みてきた。培養神経細胞で成功した小分子プローブ(DiO/DPA)の脳スライスへの導入法を検討した。DiOに代えてNeuro-DiOを用いることにより染色性を増し、小脳スライス中の神経細胞の活動電位をランダムスキャン2光子顕微鏡で記録する試みを続けたが、Neuro-DiOとDiOとの間のエネルギー共鳴効率が低く信号検出ができない、という結論に至った。GEVIは申請時のASAP3から派生した、より高感度が期待されるGEDI-2Pおよび未発表のGEVIを開発者から入手し、脳の神経細胞に発現させ脳切片標本で観察するための条件検討を続けている。本研究の対象である小脳顆粒細胞とプルキンエ細胞にGEVIを発現させるため、新生児脳内へDNAを注入してのエレクトロポレーション法を研究室で稼働させた。また、プルキンエ細胞と顆粒細胞の両方にGEVIを発現させる実験ではアデノ随伴ウィルス(AAV)による遺伝子導入法が有効と考えられ、AAV作成のためのプラスミド構築およびAAV作成系を研究室で立ち上げている。

電位依存性センサーを用いた膜電位イメージングは局所神経回路の機能的結合の解析に適するが技術的なハードルがあった。音響光学偏光器(AOD)によるXYスキャンを採用し高速に多点を計測できるランダムスキャン型2光子顕微鏡を開発し複数培養神経細胞からの同時多点活動電位計測に成功し、さらに脳スライスを用いて新世代タンパク質型膜電位センサー（GEVI)を用い大脳皮質の発達にともなう神経結合の変化を見出した実績をベースとして、本年度は脳の局所神経回路の理解を進めることを目的とし、小脳切片における複数顆粒細胞からの同時膜電位記録を試みてきた。培養神経細胞で成功した小分子プローブ(DiO/DPA)の脳スライスへの導入法を検討した。DiOに代えてNeuro-DiOを用いることにより染色性を増し、小脳スライス中の神経細胞の活動電位をランダムスキャン2光子顕微鏡で記録する試みを続けたが、Neuro-DiOとDiOとの間のエネルギー共鳴効率が低く信号検出ができない、という結論に至った。GEVIは申請時のASAP3から派生した、より高感度が期待されるGEDI-2Pおよび未発表のGEVIを開発者から入手し、脳の神経細胞に発現させ脳切片標本で観察するための条件検討を続けている。本研究の対象である小脳顆粒細胞とプルキンエ細胞にGEVIを発現させるため、新生児脳内へDNAを注入してのエレクトロポレーション法を研究室で稼働させた。また、プルキンエ細胞と顆粒細胞の両方にGEVIを発現させる実験ではアデノ随伴ウィルス(AAV)による遺伝子導入法が有効と考えられ、AAV作成のためのプラスミド構築およびAAV作成系を研究室で立ち上げている。