ピロリ菌感染胃癌の背景にあるBRCA1核移行制御機構の破綻

日本人の胃癌患者の99％は、cagA遺伝子を保有するCagA陽性ピロリ菌の慢性感染を基盤として発症する。ピロリ菌は菌体内で産生したCagA蛋白質をヒト胃上皮細胞内に注入する。CagAは上皮細胞極性の形成・維持に必須の役割を担うPAR1bに結合し、そのキナーゼ活性を抑制する結果、上皮細胞極性を破壊する。同時に、CagAはPAR1bを抑制することによりBRCA1の核移行を阻害し、ゲノム不安定性を誘導する。申請者は先行研究において、PAR1b以外のキナーゼによるリン酸化もまたBRCA1の核移行に必要であることを見出した。そこで本研究では、ヒトのキナーゼを標的としたsgRNAライブラリを利用し、BRCA1をリン酸化する責任キナーゼを同定し、CagAがキナーゼ活性に与える効果を解析する。今年度は、BRCA1の核移行を評価する実験系を構築した。相同組換え修復レポーター（HR-GFP）は、制限酵素I-SceIにより生じたDNA二本鎖切断が相同組換えによって修復された場合にのみGFPを発現する。核内BRCA1は相同組換えに必須であることから、BRCA1が核移行した細胞はGFP陽性となる。当初の計画では、ヒト胃上皮細胞由来のAGS細胞を用いてHR-GFP安定発現株を作製し、I-SceI-RFP発現ベクターを一過性導入し、「RFP陽性GFP陽性」と「RFP陽性GFP陰性」にソーティングする予定であった。しかしながら、sgRNAスクリーニングに必要となるRFP陽性細胞数が得られなかった。そこで、樹立したAGS細胞由来のHR-GFP安定発現株を用いて、Tet-onシステムでI-SceI-RFPを誘導発現する安定発現株を作製した。ドキシサイクリン添加により、ほぼ全ての細胞でI-SceI-RFPが誘導されることを確認している。

日本人の胃癌患者の99％は、cagA遺伝子を保有するCagA陽性ピロリ菌の慢性感染を基盤として発症する。ピロリ菌は菌体内で産生したCagA蛋白質をヒト胃上皮細胞内に注入する。CagAは上皮細胞極性の形成・維持に必須の役割を担うPAR1bに結合し、そのキナーゼ活性を抑制する結果、上皮細胞極性を破壊する。同時に、CagAはPAR1bを抑制することによりBRCA1の核移行を阻害し、ゲノム不安定性を誘導する。申請者は先行研究において、PAR1b以外のキナーゼによるリン酸化もまたBRCA1の核移行に必要であることを見出した。そこで本研究では、ヒトのキナーゼを標的としたsgRNAライブラリを利用し、BRCA1をリン酸化する責任キナーゼを同定し、CagAがキナーゼ活性に与える効果を解析する。今年度は、BRCA1の核移行を評価する実験系を構築した。相同組換え修復レポーター（HR-GFP）は、制限酵素I-SceIにより生じたDNA二本鎖切断が相同組換えによって修復された場合にのみGFPを発現する。核内BRCA1は相同組換えに必須であることから、BRCA1が核移行した細胞はGFP陽性となる。当初の計画では、ヒト胃上皮細胞由来のAGS細胞を用いてHR-GFP安定発現株を作製し、I-SceI-RFP発現ベクターを一過性導入し、「RFP陽性GFP陽性」と「RFP陽性GFP陰性」にソーティングする予定であった。しかしながら、sgRNAスクリーニングに必要となるRFP陽性細胞数が得られなかった。そこで、樹立したAGS細胞由来のHR-GFP安定発現株を用いて、Tet-onシステムでI-SceI-RFPを誘導発現する安定発現株を作製した。ドキシサイクリン添加により、ほぼ全ての細胞でI-SceI-RFPが誘導されることを確認している。