ピロリ菌感染胃癌の背景にあるBRCA1核移行制御機構の破綻

幽门螺杆菌感染胃癌的 BRCA1 核易位控制机制的破坏

• 批准号: 22K07068
• 负责人: 紙谷 尚子
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K07068/
• 关键词: ピロリ菌; CagA; PAR1b; BRCA1

日本人の胃癌患者の99％は、cagA遺伝子を保有するCagA陽性ピロリ菌の慢性感染を基盤として発症する。ピロリ菌は菌体内で産生したCagA蛋白質をヒト胃上皮細胞内に注入する。CagAは上皮細胞極性の形成・維持に必須の役割を担うPAR1bに結合し、そのキナーゼ活性を抑制する結果、上皮細胞極性を破壊する。同時に、CagAはPAR1bを抑制することによりBRCA1の核移行を阻害し、ゲノム不安定性を誘導する。申請者は先行研究において、PAR1b以外のキナーゼによるリン酸化もまたBRCA1の核移行に必要であることを見出した。そこで本研究では、ヒトのキナーゼを標的としたsgRNAライブラリを利用し、BRCA1をリン酸化する責任キナーゼを同定し、CagAがキナーゼ活性に与える効果を解析する。今年度は、BRCA1の核移行を評価する実験系を構築した。相同組換え修復レポーター（HR-GFP）は、制限酵素I-SceIにより生じたDNA二本鎖切断が相同組換えによって修復された場合にのみGFPを発現する。核内BRCA1は相同組換えに必須であることから、BRCA1が核移行した細胞はGFP陽性となる。当初の計画では、ヒト胃上皮細胞由来のAGS細胞を用いてHR-GFP安定発現株を作製し、I-SceI-RFP発現ベクターを一過性導入し、「RFP陽性GFP陽性」と「RFP陽性GFP陰性」にソーティングする予定であった。しかしながら、sgRNAスクリーニングに必要となるRFP陽性細胞数が得られなかった。そこで、樹立したAGS細胞由来のHR-GFP安定発現株を用いて、Tet-onシステムでI-SceI-RFPを誘導発現する安定発現株を作製した。ドキシサイクリン添加により、ほぼ全ての細胞でI-SceI-RFPが誘導されることを確認している。

99% of Japanese patients with gastric cancer have CagA-positive genes and chronic infections. The CagA protein produced in the bacteria is injected into gastric epithelial cells. CagA plays an important role in the formation and maintenance of epithelial cell polarity. It binds to PAR1b and inhibits cell activity. At the same time, CagA can inhibit PAR1b, inhibit BRCA1 nuclear migration, and induce instability. The applicant shall conduct preliminary research on the nuclear migration of BRCA1 other than PAR1b. In this study, we analyzed the activity and effects of CagA in the presence of BRCA1. This year, BRCA1 's review of the migration process is under way. HR-GFP is a protein that is expressed in the presence of a restriction enzyme I-SceI that binds DNA to two DNA strands and in the presence of HR-GFP. BRCA1 nuclear transition cells must be GFP positive. In the initial study, we used HR-GFP stable cells derived from gastric epithelial cells to produce I-SceI-RFP stable cells, transient induction,"RFP positive GFP positive,""RFP positive GFP negative," and "RFP positive GFP negative." The number of RFP-positive cells was determined by the number of sgRNA cells. HR-GFP stable developing strains derived from AGS cells were established and produced using Tet-on-cell and I-SceI-RFP induction. To confirm the induction of I-SceI-RFP in the whole cell line

项目成果

The Helicobacter pylori CagA oncoprotein inhibits DNA damage-induced apoptosis through Hippo signal activation.

幽门螺杆菌 CagA 癌蛋白通过 Hippo 信号激活抑制 DNA 损伤诱导的细胞凋亡。

• 发表时间: 2022
• 作者: Naoko Kamiya;Takuya Ooki;Masanori Hatakeyama.
• 通讯作者: Masanori Hatakeyama.