Development of a simple and rapid diagnostic method for using miRNA as a biomarker

Micro RNA （miRNA）は約20-25塩基の1本鎖RNAで疾患特異的なバイオマーカーとしての応用が報告されている。miRNAは、マイクロアレイ、Next generation sequencer (NGS)による網羅的解析データを基にしているが簡便な迅速検出法がないためいまだ臨床現場で有効利用されていないのが現状である。初年度は、内在性コントロールを含む4種類の標的miRNAについてオリジナルIso-RAM測定法（Yao et.al. RNA 2009）の煩雑な工程と測定時間短縮を目標にした改良Iso-RAM反応条件設定を行った。オリジナル法は、基本増幅単位である環状DNA構造作成の前処理とDNA増幅工程（Iso-RAM）の2段階からなる。前処理は、さらに逆転転写工程、リボヌクレアーゼ工程、Ligation工程からなり、作成環状DNAをRCA (Rolling circle amplification) を基本とする工程で増幅、最終的にIso-RAMは4工程からなる。改良Iso-RAMでは、逆転写後に標的miRNAを分解、ブリッジprimerの架橋を作るリボヌクレアーゼ工程を省略した。50-60℃で動的平衡状態にあるmiRNA由来のcDNA配列を含むRT-primerから環状基本構造を作製できると予測した。リボヌクレアーゼ工程を省略したIso-RAM産物をアガロース電気泳動、標的Bandをゲルから切り出しDNAを抽出、ダイレクトシーケンシングで基本構造がオリジナルIso-RAM反応による配列と同一であることを確認した。さらに工程簡略化を目指し逆転写、Ligation工程を同時におこうための至適反応条件を検討、オリジナル法が必要とした140分を90分に短縮、全4工程を2工程に短縮できた。この測定条件を用いて内在性コントロールを含む候補miRの基礎検討も行った。

Micro RNA （miRNA）は約20-25塩基の1本鎖RNAで疾患特異的なバイオマーカーとしての応用が報告されている。miRNAは、マイクロアレイ、Next generation sequencer (NGS)による網羅的解析データを基にしているが簡便な迅速検出法がないためいまだ臨床現場で有効利用されていないのが現状である。初年度は、内在性コントロールを含む4種類の標的miRNAについてオリジナルIso-RAM測定法（Yao et.al. RNA 2009）の煩雑な工程と測定時間短縮を目標にした改良Iso-RAM反応条件設定を行った。オリジナル法は、基本増幅単位である環状DNA構造作成の前処理とDNA増幅工程（Iso-RAM）の2段階からなる。前処理は、さらに逆転転写工程、リボヌクレアーゼ工程、Ligation工程からなり、作成環状DNAをRCA (Rolling circle amplification) を基本とする工程で増幅、最終的にIso-RAMは4工程からなる。改良Iso-RAMでは、逆転写後に標的miRNAを分解、ブリッジprimerの架橋を作るリボヌクレアーゼ工程を省略した。50-60℃で動的平衡状態にあるmiRNA由来のcDNA配列を含むRT-primerから環状基本構造を作製できると予測した。リボヌクレアーゼ工程を省略したIso-RAM産物をアガロース電気泳動、標的Bandをゲルから切り出しDNAを抽出、ダイレクトシーケンシングで基本構造がオリジナルIso-RAM反応による配列と同一であることを確認した。さらに工程簡略化を目指し逆転写、Ligation工程を同時におこうための至適反応条件を検討、オリジナル法が必要とした140分を90分に短縮、全4工程を2工程に短縮できた。この測定条件を用いて内在性コントロールを含む候補miRの基礎検討も行った。