Development of a simple and rapid diagnostic method for using miRNA as a biomarker

开发一种使用 miRNA 作为生物标志物的简单快速的诊断方法

• 批准号: 22K07486
• 负责人: 井平 勝
• 金额: $ 2.58万
• 依托单位: Fujita Health University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K07486/
• 关键词: miRNA; バイオマーカ; Iso-RAM; Isothermal amplification; Biomarker; ISO-RAM; LAMP

Micro RNA （miRNA）は約20-25塩基の1本鎖RNAで疾患特異的なバイオマーカーとしての応用が報告されている。miRNAは、マイクロアレイ、Next generation sequencer (NGS)による網羅的解析データを基にしているが簡便な迅速検出法がないためいまだ臨床現場で有効利用されていないのが現状である。初年度は、内在性コントロールを含む4種類の標的miRNAについてオリジナルIso-RAM測定法（Yao et.al. RNA 2009）の煩雑な工程と測定時間短縮を目標にした改良Iso-RAM反応条件設定を行った。オリジナル法は、基本増幅単位である環状DNA構造作成の前処理とDNA増幅工程（Iso-RAM）の2段階からなる。前処理は、さらに逆転転写工程、リボヌクレアーゼ工程、Ligation工程からなり、作成環状DNAをRCA (Rolling circle amplification) を基本とする工程で増幅、最終的にIso-RAMは4工程からなる。改良Iso-RAMでは、逆転写後に標的miRNAを分解、ブリッジprimerの架橋を作るリボヌクレアーゼ工程を省略した。50-60℃で動的平衡状態にあるmiRNA由来のcDNA配列を含むRT-primerから環状基本構造を作製できると予測した。リボヌクレアーゼ工程を省略したIso-RAM産物をアガロース電気泳動、標的Bandをゲルから切り出しDNAを抽出、ダイレクトシーケンシングで基本構造がオリジナルIso-RAM反応による配列と同一であることを確認した。さらに工程簡略化を目指し逆転写、Ligation工程を同時におこうための至適反応条件を検討、オリジナル法が必要とした140分を90分に短縮、全4工程を2工程に短縮できた。この測定条件を用いて内在性コントロールを含む候補miRの基礎検討も行った。

Micro RNA (miRNA) is a disease-specific RNA with approximately 20-25 kilobases and is used to report the disease. miRNAは、マイクロアレイ、Next generation sequencer (NGS) The analysis of the による snare is easy and quick. The effective use of the method at the clinical site is the current situation of the method. In the first year of the year, the endogenous RNA contained 4 types of targeted miRNAs, the RNA Iso-RAM assay (Yao et.al. RNA 2009) The project aims to shorten the measurement time and improve the Iso-RAM reflection condition setting. The Iso-RAM method is a 2-stage pre-processing method for creating a circular DNA structure based on the basic amplification unit. Pre-processing, さらに reverse writing process, リボヌクレアーゼ process, ligation process からなり, circular DNA creation RCA (Rolling circle amplification)をBasic とするProject でAmplification, final にIso-RAM は4 Project からなる. Improved Iso-RAM, decomposition of target miRNA after inverse writing, and omission of primer bridging engineering. The equilibrium state of 50-60℃ is the origin of the miRNA, and the cDNA arrangement contains the RT-primer and the basic structure of the ring is produced and predicted.リボヌクレアーゼengineering omissionしたIso-RAM product をアガロースelectrophoresis, target Bandをゲルから Cutり出しDNAをExtraction, ダイレクトシーケンシングでbasic structure がオリジナルIso-RAM reverse による arrangement and the same であることをconfirmationした.さらにengineering simplificationをobject designationしreverse writing, ligation engineeringをsimultaneityにおこうための to the counterproductive conditionsを検 Discussion, オリジナル法がとした140 minutes, 90 minutes, shortening, all 4 processes, 2 processes, shortening, できた. The measurement conditions are based on the intrinsic properties of the candidate miR and the basis of the test is determined.