新規ベクターを用いた血液系遺伝病の安全なゲノム編集治療技術の開発

利用新型载体开发针对血液遗传疾病的安全基因组编辑治疗技术

• 批准号: 22K07852
• 负责人: 三谷 幸之介
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Saitama Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K07852/
• 关键词: プライム編集; ゲノム編集; アデノウイルスベクター; iPS 細胞; prime editing; ウイルスベクター; SCID-X1

アデノウイルスベクターによる高効率なprime editing（PE）を達成する上で、PE4（PE2の改良型）遺伝子と変異Venus遺伝子を標的とするepegRNA（pegRNAの改良型）との比を調節可能にするために、敢えて別々のベクターとして構築した。PE4発現ベクターが増殖しにくいという問題が生じたが、PE4遺伝子のORFに変異を入れたベクターは増殖するため、PE4遺伝子の116細胞での発現が何らかの問題である。そこで、1) PE4遺伝子の3’非翻訳領域に293細胞（116細胞の親細胞株）での発現を抑制するmiR183/218を4コピーずつ挿入し、2) PE4遺伝子のプロモーターをCMVからそれよりも弱いEF1αへと置き換えた。その結果、PE4ベクターもVenus-epegRNAも高力価（1.7 x 10E10/mlと4.2 x 10E10/ml）で増殖させることが出来た。これらベクターは、先ずAd5血清型のヘルパーウイルスで調整した。ベクターの感染によるPEの効率を測定するために、A549、HepG2、Hep3B、ヒトiPS細胞に対して、変異Venus遺伝子が染色体に組み込まれた細胞をそれぞれ樹立した。感染実験の結果、A549ではMOI 300（細胞あたりの感染粒子）で94%、HepG2ではMOI 30で92%、Hep3BではMOI 100で51%、ヒトiPS細胞ではMOI 30で30%と、これまでの報告を大きく上回る高効率でPEが得られた。しかしながら、CAG-Venusベクターを用いた感染と比較すると、遺伝子導入された細胞の1/3~1/2 でのみPEが達成されていた。最近、HDAC6 阻害剤の処理で293T細胞におけるPEの効率が最高2.3倍上昇することが報告された。そこで、私達もHDAC6阻害剤処理を試みたが、更なる効率の上昇は見られなかった。

为了用腺病毒载体实现高效的Prime编辑（PE），故意将矢量构造为单独的向量，以调整针对突变体Venus基因的PE4（改善PE2）基因与Epegrna（改善PEGRNA）的比率。出现的问题是，PE4表达载体很难增殖，但是由于PE4基因在ORF中含有突变的向量生长，因此PE4基因在116个细胞中的表达是某种问题。因此，将4个MiR183/218的副本抑制在293个细胞中（116个父母细胞系）中的表达，将PE4基因的3'未翻译区域插入，而2）2）5）50％PE4基因启动子的50％由CMV替换为CMV，由CMV替换为弱EF1α。结果，PE4载体和金星 - epegrna都可以在高滴度（1.7 x 10e10/ml和4.2 x 10e10/ml）上生长。这些载体首先是用AD5血清型的辅助病毒制备的。为了测量PE在感染载体后的效率，将突变的金星基因掺入了染色体中，分别建立了染色体中的染色体，HEPG2，HEP3B和人IPS细胞分别建立。由于感染实验，以高效率获得了PE，其明显高于先前的报告，A549中的MOI为300（每个细胞感染颗粒），MOI为30％，MOI为30％，PE为30％，PE为30％，PE的效率很高，其效率很大。但是，与用Cag-venus载体感染相比，仅在1/3-1/2的转基因细胞中实现PE。最近，据报道，用HDAC6抑制剂治疗可提高293T细胞中PE的效率高达2.3倍。因此，我们还试图治疗HDAC6抑制剂，但未观察到进一步的效率。