新規ベクターを用いた血液系遺伝病の安全なゲノム編集治療技術の開発

利用新型载体开发针对血液遗传疾病的安全基因组编辑治疗技术

• 批准号: 22K07852
• 负责人: 三谷 幸之介
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Saitama Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K07852/
• 关键词: プライム編集; ゲノム編集; アデノウイルスベクター; iPS 細胞; prime editing; ウイルスベクター; SCID-X1

アデノウイルスベクターによる高効率なprime editing（PE）を達成する上で、PE4（PE2の改良型）遺伝子と変異Venus遺伝子を標的とするepegRNA（pegRNAの改良型）との比を調節可能にするために、敢えて別々のベクターとして構築した。PE4発現ベクターが増殖しにくいという問題が生じたが、PE4遺伝子のORFに変異を入れたベクターは増殖するため、PE4遺伝子の116細胞での発現が何らかの問題である。そこで、1) PE4遺伝子の3’非翻訳領域に293細胞（116細胞の親細胞株）での発現を抑制するmiR183/218を4コピーずつ挿入し、2) PE4遺伝子のプロモーターをCMVからそれよりも弱いEF1αへと置き換えた。その結果、PE4ベクターもVenus-epegRNAも高力価（1.7 x 10E10/mlと4.2 x 10E10/ml）で増殖させることが出来た。これらベクターは、先ずAd5血清型のヘルパーウイルスで調整した。ベクターの感染によるPEの効率を測定するために、A549、HepG2、Hep3B、ヒトiPS細胞に対して、変異Venus遺伝子が染色体に組み込まれた細胞をそれぞれ樹立した。感染実験の結果、A549ではMOI 300（細胞あたりの感染粒子）で94%、HepG2ではMOI 30で92%、Hep3BではMOI 100で51%、ヒトiPS細胞ではMOI 30で30%と、これまでの報告を大きく上回る高効率でPEが得られた。しかしながら、CAG-Venusベクターを用いた感染と比較すると、遺伝子導入された細胞の1/3~1/2 でのみPEが達成されていた。最近、HDAC6 阻害剤の処理で293T細胞におけるPEの効率が最高2.3倍上昇することが報告された。そこで、私達もHDAC6阻害剤処理を試みたが、更なる効率の上昇は見られなかった。

Youdaoplaceholder0 による スベ スベ タ タ による による high efficiency なprime Editing (PE) を reached す る で, PE4 (PE2 の modified form) heritage 伝 son と - traces of different Venus 伝 を son mark と す る epegRNA (pegRNA の modified form) と の than を adjustment may に す る た め に, dare え て don't 々 の ベ ク タ ー と し て build し た. PE4 発 now ベ ク タ ー が raised colonization し に く い と い う problem が raw じ た が, PE4 but 伝 の ORF に - different を into れ た ベ ク タ ー は raised colonization す る た め 116 cells, PE4 but 伝 の で の 発 now what が ら か の problem で あ る. そ こ で, 1) PE4 but 伝 の 3 'not turn 訳 field に 293 cells (116 cell の pro cell lines) で の 発 now を inhibit す る miR183/218 を 4 コ ピ ー ず つ scions し, 2) PE4 posthumous son 伝 の プ ロ モ ー タ ー を CMV か ら そ れ よ り も weak い EF1 alpha へ と buy き in え た. そ の results, PE4 ベ ク タ ー も Venus - epegRNA も colliers 価 (4.2 x 1.7 x 10 e10 / ml と 10 e10 / ml) で raised colonization さ せ る こ と が た. Youdaoplaceholder6 れらベ タ タ タ タ タ た, first ずAd5 serotype <s:1> ヘ パ パ ウ ウ ウ ウ ウ ウ スで スで スで adjust た た. ベ ク タ ー の infection に よ る PE の を sharper rate determination す る た め に, A549, HepG2, Hep3B, ヒ ト iPS cells に し seaborne て, - different Venus but 伝 が chromosome に group み 込 ま れ た cells を そ れ ぞ れ set し た. Infection be 験 の results, A549 で は MOI 300 cells (あ た り の infection particles) 94%, HepG2 で で は MOI で 92%, 30 Hep3B で は MOI 100 51%, ヒ で ト iPS cells で は MOI 30 で 30% と, こ れ ま で の report を big き く る high working rate で PE が last time ら れ た. し か し な が ら, the CAG - Venus ベ ク タ ー を with い た infection と more す る と, but 伝 import さ れ た cells の 1/3 ~ 1/2 で の み PE が reached さ れ て い た. Recently, HDAC6 resistance against tonic の 処 Richard で 293 t cells に お け る PE の が sharper rate 2.3 times the highest rise す る こ と が report さ れ た. Youdaoplaceholder0 で で, the を test of the treatment with the loda <s:1> HDAC6 damage inhibitor みたが, and the なる efficiency <s:1> increased られな. See られな った った.