权益分类	功能权益	普通用户	{{item.name}}会员
{{category.name}}	{{benefitItem.name}}

新規ベクターを用いた血液系遺伝病の安全なゲノム編集治療技術の開発

利用新型载体开发针对血液遗传疾病的安全基因组编辑治疗技术

基本信息

批准号：
22K07852
负责人：
三谷幸之介
金额：
$ 2.75万
依托单位：
Saitama Medical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

アデノウイルスベクターによる高効率なprime editing（PE）を達成する上で、PE4（PE2の改良型）遺伝子と変異Venus遺伝子を標的とするepegRNA（pegRNAの改良型）との比を調節可能にするために、敢えて別々のベクターとして構築した。PE4発現ベクターが増殖しにくいという問題が生じたが、PE4遺伝子のORFに変異を入れたベクターは増殖するため、PE4遺伝子の116細胞での発現が何らかの問題である。そこで、1) PE4遺伝子の3’非翻訳領域に293細胞（116細胞の親細胞株）での発現を抑制するmiR183/218を4コピーずつ挿入し、2) PE4遺伝子のプロモーターをCMVからそれよりも弱いEF1αへと置き換えた。その結果、PE4ベクターもVenus-epegRNAも高力価（1.7 x 10E10/mlと4.2 x 10E10/ml）で増殖させることが出来た。これらベクターは、先ずAd5血清型のヘルパーウイルスで調整した。ベクターの感染によるPEの効率を測定するために、A549、HepG2、Hep3B、ヒトiPS細胞に対して、変異Venus遺伝子が染色体に組み込まれた細胞をそれぞれ樹立した。感染実験の結果、A549ではMOI 300（細胞あたりの感染粒子）で94%、HepG2ではMOI 30で92%、Hep3BではMOI 100で51%、ヒトiPS細胞ではMOI 30で30%と、これまでの報告を大きく上回る高効率でPEが得られた。しかしながら、CAG-Venusベクターを用いた感染と比較すると、遺伝子導入された細胞の1/3~1/2 でのみPEが達成されていた。最近、HDAC6 阻害剤の処理で293T細胞におけるPEの効率が最高2.3倍上昇することが報告された。そこで、私達もHDAC6阻害剤処理を試みたが、更なる効率の上昇は見られなかった。

High efficiency prime editing (PE) can be achieved by adjusting the ratio of pegRNA (modified pegRNA) to PE4 (modified pegRNA). The ORF of PE4 gene is different from that of PE4 gene. The ORF of PE4 gene is different from that of PE4 gene. 1) Inhibition of miR183/218 expression in the 3 'non-inverted domain of PE4 gene in 293 cells (116 cells and parent cell lines) 2) Inhibition of miR183/218 expression in 3' non-inverted domain of PE4 gene in CMV expression in 293 cells (116 cells and parent cells) The results, PE4, Venus-epegRNA, high strength (1.7 x 10E10/ml and 4.2 x 10E10/ml), increase in growth and development. This is the first time that serotype Ad5 has been adjusted. The infection rate of PE was measured in A549, HepG2, Hep3B and iPS cells. The infection rate was 94% for A549, 92% for HepG2, 51% for Hep3B, 30% for iPS, and 94% for A549. CAG-Venus is introduced into cells 1/3~1/2 of the time. Recently, HDAC6 inhibitor treatment of 293T cells, PE efficiency increased by up to 2.3 times, this report HDAC6 resistance test results show that the resistance test results show that: