アデノウイルスベクターを用いた高効率標的組換え法の開発

利用腺病毒载体开发高效靶向重组方法

• 批准号: 07260207
• 负责人: 三谷 幸之介
• 金额: $ 1.92万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-07260207/
• 关键词: 標的組み換え; アデノウイルスベクター; ES細胞; Hprt遺伝子

マウスHprt遺伝子座のエクソン2と3をカバーする染色体領域6.6キロ塩基対、5.9キロ塩基対、4.6キロ塩基対を含むDNA断片を、E1,E3欠損型アデノウイルスベクターを作成するためのトランスファープラスミドにサブクローニングした。いずれのコンストラクトもネオマイシン耐性遺伝子がエクソン3に挿入されており、標的組み換えによりHprt遺伝子が破壊された細胞を、ネオマイシン耐性と6-チオグアニン耐性により、選別できる。これらのプラスミドより、6.6キロ塩基対のDNAからは、すでにウイルスを作成した。しかし、Hprt欠損細胞の6-チオグアニンによる選択は、あまり効きがよくなく、突然変異によりHprt欠損になる細胞が出現する頻度も比較的高い、などの問題点があることが判明した。そこで、ネオマイシン耐性遺伝子の挿入がない正常な6.7塩基対のHprt染色体DNAが挿入されたアデノウイルスベクターも作成した。また、染色体Hprt遺伝子エクソン3内にネオマイシン耐性遺伝子の挿入があるHprt欠損ES細胞を入手した。この細胞に正常のHprt配列を持つウイルスを感染させHprt欠損が修復された細胞をHAT培地により選択し、標的相同組み換えによって遺伝子上の変異を正常に修復する効率を検討した。その結果、アデノウイルスベクターを用いた方が電気穿孔法よりも40倍以上相同組み換えを起こす効率が明らかとなった。さらに、よりよい相同組換えの効率を得るためのアデノウイルス感染条件の検討を行った。細胞あたりのウイルス粒子の数が25と250では効率はほぼ等しかった。細胞は培地に懸濁された状態よりもディッシュに付着した状態がよく、感染に用いる緩衝液はリン酸バッファーよりも培養用培地の方が効率が高かった。

The chromosomal domain is 6.6, 5.9, 4.6, and contains DNA fragments, E1, E3, and DNA fragments in the chromosomal field of 6. 6, 5. 9, and 4. 6 respectively. This is the first time that you can learn about your endurance. If you want to know how to do this, you will need to know how to change your endurance. You will need to learn more about your endurance. You will need to learn more about your endurance. If you choose another one, you will need to know if you are going to lose your patience. If you choose another one, you will need to know if you are going to be able to use Hprt. I don't know what to do. I don't know. I don't know. The error rate of the Hprt is higher than that of the Hprt, and the error rate is higher than that of the control cell. the temperature is higher than the value of the cell. The DNA of the Hprt chromosome was transferred into the genome of the patient in the normal condition. The chromosomal Hprt gene, the chromosome ES cell, the cell, the cell. In the same group of cells, the normal Hprt configuration, the normal cell configuration, the Hprt infection rate, the Hprt infection rate, the cell repair rate, the cell temperature, the cell temperature, the temperature and the temperature. The results show that the failure rate of the same group is more than 40 times higher than that of the same group, and the failure rate is more than 40 times that of the same group. The rate of infection in the same group was higher than that in the same group. the infection condition was different. Cell count, particle count, cell count, particle count, particle count, cell count, particle count, cell count, particle count, particle count, cell count, particle count The rate of infection is very high, and the rate of infection is very high.