PNHクローンの起源と変遷

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本研究では、発作性夜間ヘモグロビン尿症（PNH）患者から得た単細胞レベルの全ゲノムシークエンスデータを用いて遺伝学的系統樹解析を行い、PNHクローンの発生から臨床的なPNH発症に至る過程を明らかにすることを目的としている。本年度は、大阪大学大学院医学系研究科血液・腫瘍内科に通院中の2名のPNH患者の骨髄検体を用いて研究を行った。1名は、PIGA遺伝子変異に加えてHMGA2遺伝子変異を認める症例であり、もう1名は複数の異なるPIGA遺伝子変異が認められた症例である。患者から採取した骨髄細胞を単核球に分離し、フローサイトメトリーを用いて、造血幹細胞レベルの細胞集団をPNH分画（CD55/59陰性）とnon-PNH分画（CD55/59陽性）に分けた。次に、メチルセルロースを培地として、TPO、SCF、IL3などのサイトカインを用いてコロニー形成細胞アッセイで細胞増殖を行った。形成されたコロニーから、カラム法を用いてDNAを抽出した。それぞれのコロニーが隣接するコロニーとのコンタミネーションがない場合、単細胞を由来とする細胞集団と考えられるため、コロニーから得られたDNAも単細胞由来であるとして研究を行うことが可能である。DNAのクオリティーチェックを行い、次世代シークエンサーによる全ゲノム解析が可能なものを選択し、ライブラリー作成を行った。その後、次世代シークエンサーを用いて全ゲノム解析を実施し、全ゲノムシーケンスデータを取得した。