ES細胞を用いたヒルシュスプルング病の病態解明および治療戦略構築のための基盤研究

阐明先天性巨结肠的病理学并开发使用 ES 细胞的治疗策略的基础研究

• 批准号: 22K08721
• 负责人: 藤原 なほ
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Juntendo University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K08721/
• 关键词: 腸管神経幹細胞; ヒルシュスプルング病; ES細胞; 細胞移植; 再生医療; 腸管神経; Hirschsprung病

本研究では、新規ES細胞を樹立することで未だ解明されていない腸管神経系の発生メカニズムの解析をもとにH病の病態解明を行い、さらには新しい治療リソースとして革新的な細胞治療方法の臨床応用に展開するための基礎研究を行う。SOX10-VENUSマウスから新規ES細胞を樹立し、これを用いて基礎的なENS発生過程を経時的に観察、腸管神経幹細胞の誘導を行う。さらに、同細胞を用いた移植実験を予定する。同時にSOX10-VENUSマウスから作成した神経塊を用いてH病腸管部位の細胞環境の解析を行うことで、神経発達促進因子を探索し、幹細胞移植後の生着・発達を促進する物質をその後の移植実験でも検証することが可能となる。今年度は、新規ES細胞の作成と腸管神経幹細胞への分化誘導方法確立に取り組んだ。新規に樹立したSV-mES細胞から胚様体を作成し、特定のサイトカイン・増殖因子（bFGF, EGF）を含む無血清培地にて培養開始し、ハンギングドロップ法でEB細胞を作製。3日目からSOX10発現が蛍光顕微鏡下で確認可能となった。これを浮遊培養に移行し、神経細胞塊としてDual Smad Inhibition法で効率的に分化誘導を行う。細胞免疫染色とリアルタイムRT-PCRを用いて分化の判定を行う予定である。

在这项研究中，我们将通过建立新的ES细胞来研究H疾病的病理，并基于对肠道神经系统发育的机制的分析，还将进行基础研究以开发创新的细胞疗法作为新的治疗资源。从Sox10-Venus小鼠中建立了新的ES细胞，并且随着时间的推移观察到基础ENS发育过程，并诱导肠神经干细胞。此外，将计划使用相同细胞的移植实验。同时，通过使用由Sox10-Venus小鼠产生的神经肿块分析H疾病肠道部位的细胞环境，可以在随后的移植实验中搜索神经发育促进因子并验证干细胞移植后干细胞后促进插入和发育的物质。今年，我们致力于创建新的ES细胞并建立诱导分化为肠神经干细胞的方法。胚胎体是由新建立的SV-MES细胞产生的，并在含有特定细胞因子和生长因子（BFGF，EGF）的无血清培养基中培养，并使用悬挂滴法产生EB细胞。从第三天开始，在荧光显微镜下，Sox10表达变得可见。这被转移到浮动培养物中，并使用双重SMAD抑制方法有效地将分化作为神经元肿块。将使用细胞免疫染色和实时RT-PCR确定分化。

项目成果

IN-VITRO TRANSPLANTATION OF ENTERIC NEURAL CREST CELLS FROM SOX10-VENUS MOUSE EMBRYONIC STEM CELLS IN THE GUT OF THE ENDOTHELIN RECEPTOR B NULL MOUSE MODEL.

内皮素受体 B 空鼠模型肠道中 SOX10-VENUS 小鼠胚胎干细胞的肠神经嵴细胞的体外移植。

• 发表时间: 2022
• 作者: N Fujiwara;K Miyahara;N Nakazawa-Tanaka;A YamatakaT.
• 通讯作者: A YamatakaT.

TRANSPLANTATION OF SOX10-VENUS MOUSE EMBRYONICAGANGLIONIC GUT IN A MOUSE MODELCOMPARATIVE DIFFERENTIATION OF ENTERIC NEURAL CREST-DERIVED CELLS CO-CULTURED WITH GANGLIONIC GUT IN A MOUSE MODEL.

SOX10-Venus 小鼠胚胎神经节肠在小鼠模型中的移植在小鼠模型中与神经节肠共培养的肠神经嵴衍生细胞的比较分化。

• 发表时间: 2022
• 作者: N Fujiwara;K Miyahara;N Nakazawa-Tanaka;A YamatakaT.
• 通讯作者: A YamatakaT.

In vitro investigation of the differentiation of enteric neural crest-derived cells following transplantation of aganglionic gut in a mouse model

小鼠模型无神经节肠移植后肠神经嵴衍生细胞分化的体外研究

• DOI: 10.1007/s00383-022-05105-2
• 发表时间: 2022
• 期刊: Pediatric Surgery International
• 影响因子: 1.8
• 作者: Fujiwara Naho;Miyahara Katsumi;Nakazawa-Tanaka Nana;Akazawa Chihiro;Yamataka Atsuyuki
• 通讯作者: Yamataka Atsuyuki

In vitro共培養モデルを用いたマウス腸管神経幹細胞の発生過程の検証

利用体外共培养模型验证小鼠肠神经干细胞的发育过程

• 发表时间: 2022
• 作者: 藤原なほ;宮原克;田中奈々;山高篤行
• 通讯作者: 山高篤行

COMPARATIVE DIFFERENTIATION OF ENTERIC NEURAL CREST-DERIVED CELLS CO-CULTURED WITH GANGLIONIC GUT IN A MOUSE MODEL

小鼠模型中肠神经嵴衍生细胞与神经节肠共培养的比较分化

• 发表时间: 2022
• 作者: N Fujiwara;K Miyahara;N Nakazawa-Tanaka;A YamatakaT.
• 通讯作者: A YamatakaT.