Investigation of mechanism by which advanced colorectal cancer progresses EMAST-relating malignancy in hypoxia

缺氧条件下晚期结直肠癌进展为 EMAAST 相关恶性肿瘤的机制研究

• 批准号: 22K08810
• 负责人: 有田 通恒
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Toho University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K08810/
• 关键词: EMAST; 低酸素; p53; CRISPR-Cas9; マイクロサテライト不安定; 進行大腸癌; 悪性化機構

EMAST腫瘍とその悪性度との相関性を基盤とした進行大腸癌悪性化機構の解明には、臨床をより精緻に再現するEMAST誘導条件を決め、その条件下でEMASTを示す細胞を分取して解析する必要がある。初年度は、培養細胞内でのEMAST発生を生きたまま検出できるレポーター細胞株の作製に着手し、完成まであと一歩である。作製過程で、当初に計画したレポーターの遺伝子構成を変更する必要性が浮上したため、以下に改良点を記載する。レポーター細胞株は、EMAST配列と蛍光タンパク質 (FP) 遺伝子から構成されるレポーターカセットをゲノムに組み込むことで作製する。レポーターカセットは蛍光タンパク質遺伝子の前にEMAST配列を配置することで、その配列長に応じて後続FP遺伝子の発現のオン・オフが決まる。バリエーションは、配列長に変化が生じれば発現がオンになるOut-of-frame to In-frame (O2I) 型と配列長の変化でオフになるIn-frame to Out-of-frame (I2O) 型とが考えられる。当初は、FP発現がオンとなることでEMASTを検出できるO2I型の方が細胞分取に有利と考えたが、現状のEMAST誘導条件が陽性率数％と低いことに鑑みると、I2O型の方がより広範なEMASTを検出でき感度が高くなるため適している。そこで、EMAST判定用のFPとしてGFP遺伝子を、また、レポーターカセット保有細胞の追跡用FPとしてVenus遺伝子を組み込んだレポーターカセットに改変した。また、I2O型でオフとなった際に明確に判定ができるよう、意図せぬ翻訳開始点からのFP漏出発現を極力抑えられるな工夫も加えてレポーター細胞株の作製を継続している。

EMAST swollen sores と そ の 悪 sex degrees と の phase masato sex を base plate と し た for colorectal cancer agency の interpret a 悪 gender に は, clinical を よ り delicate に reappearance す る EMAST induction conditions を め and そ の conditions で EMAST を を of す cells can divide し て parsing す る necessary が あ る. Early annual は, cultivating cells で の EMAST 発 raw を raw き た ま ま 検 out で き る レ ポ ー タ ー に hands し and completion of the cell lines の cropping ま で あ と one step で あ る. で system process, original に project し た レ ポ ー タ ー の heritage 伝 composed を - more す る necessity が float on し た た め recorded, the following に improvement point を す る. レ ポ ー タ ー cell lines は, EMAST match column と 蛍 light タ ン パ ク mass (FP) posthumous son 伝 か ら constitute さ れ る レ ポ ー タ ー カ セ ッ ト を ゲ ノ ム に group み 込 む こ と で cropping す る. レ ポ ー タ ー カ セ ッ ト は 蛍 light タ ン パ ク qualitative heritage 伝 son before の に EMAST match column を configuration す る こ と で, そ の with long column に 応 じ て 続 after traces of FP 伝 son の 発 is の オ ン · オ フ が definitely ま る. バ リ エ ー シ ョ ン は, long match column に variations change が raw じ れ ば 発 now が オ ン に な る Out - of - frame to the In - frame type (O2I) と with long column の variations change で オ フ に な る In - frame to Out - of - frame type (I2O) と が exam え ら れ る. Original は, FP 発 now が オ ン と な る こ と で EMAST を 検 out で き る O2I type の party が cells divide に favorable と exam え た が, status の EMAST induction conditions が low positive rate for % と い こ と に guide み る と, I2O model の が よ り hiroo van な EMAST を 検 out で き sensitivity high が く な る た め optimum し て い る. そ こ で, EMAST judgement with の FP と し て GFP heritage 伝 を, ま た, レ ポ ー タ ー カ セ ッ ト retain cell の tracing using FP と し て Venus heritage 伝 son を group み 込 ん だ レ ポ ー タ ー カ セ ッ ト に change - し た. ま た, I2O で オ フ と な っ た interstate に clear に determine が で き る よ う, Italy 図 せ ぬ 訳 start point か ら の FP leakage 発 を now strongly inhibitory え ら れ る な time も plus え て レ ポ ー タ ー cell lines の cropping を 継 続 し て い る.