Investigation of mechanism by which advanced colorectal cancer progresses EMAST-relating malignancy in hypoxia

缺氧条件下晚期结直肠癌进展为 EMAAST 相关恶性肿瘤的机制研究

• 批准号: 22K08810
• 负责人: 有田 通恒
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Toho University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K08810/
• 关键词: EMAST; 低酸素; p53; CRISPR-Cas9; マイクロサテライト不安定; 進行大腸癌; 悪性化機構

EMAST腫瘍とその悪性度との相関性を基盤とした進行大腸癌悪性化機構の解明には、臨床をより精緻に再現するEMAST誘導条件を決め、その条件下でEMASTを示す細胞を分取して解析する必要がある。初年度は、培養細胞内でのEMAST発生を生きたまま検出できるレポーター細胞株の作製に着手し、完成まであと一歩である。作製過程で、当初に計画したレポーターの遺伝子構成を変更する必要性が浮上したため、以下に改良点を記載する。レポーター細胞株は、EMAST配列と蛍光タンパク質 (FP) 遺伝子から構成されるレポーターカセットをゲノムに組み込むことで作製する。レポーターカセットは蛍光タンパク質遺伝子の前にEMAST配列を配置することで、その配列長に応じて後続FP遺伝子の発現のオン・オフが決まる。バリエーションは、配列長に変化が生じれば発現がオンになるOut-of-frame to In-frame (O2I) 型と配列長の変化でオフになるIn-frame to Out-of-frame (I2O) 型とが考えられる。当初は、FP発現がオンとなることでEMASTを検出できるO2I型の方が細胞分取に有利と考えたが、現状のEMAST誘導条件が陽性率数％と低いことに鑑みると、I2O型の方がより広範なEMASTを検出でき感度が高くなるため適している。そこで、EMAST判定用のFPとしてGFP遺伝子を、また、レポーターカセット保有細胞の追跡用FPとしてVenus遺伝子を組み込んだレポーターカセットに改変した。また、I2O型でオフとなった際に明確に判定ができるよう、意図せぬ翻訳開始点からのFP漏出発現を極力抑えられるな工夫も加えてレポーター細胞株の作製を継続している。

为了阐明弹性肿瘤及其恶性肿瘤之间的恶性肿瘤机制，有必要确定更精确地在临床上重现的弹性诱导条件，并在这些条件下对表现出弹性的细胞进行分类和分析。在第一年，我们开始创建一个记者细胞系，该细胞系可以检测到培养的细胞中的弹性开发，而我们距离完成仅一步。随着在生产过程中改变最初计划的记者的遗传组成的需求，下面描述了改进。记者细胞系是通过结合记者的盒子来创建的，该盒子由弹性序列和荧光蛋白（FP）基因组成。通过将弹性序列放在记者盒中荧光蛋白基因的前面，随后的FP基因的表达取决于序列长度。可以认为变体是与框架内（O2i）类型的未框架，它在序列长度变化时打开，并在框架外（I2O）类型中打开，当序列长度变化时，它会关闭。最初，我们认为可以通过打开FP表达来检测EMAST的O2I类型对于细胞分类更有优势，但是考虑到当前的Emast诱导条件在仅在几％的正速率下较低，因此I2O类型更合适，因为它检测到更大的Emast范围，并且是敏感的。因此，将GFP基因修饰为弹性测定的FP，并将金星基因作为跟踪携带记者盒的细胞的FP的记者盒式盒子进行了修饰。此外，为了在关闭I2O类型时做出明确的判断，通过努力将FP泄漏表达的表达从意外的翻译起点起点最小化，继续进行记者细胞系。