Investigation of mechanism by which advanced colorectal cancer progresses EMAST-relating malignancy in hypoxia

点击翻译按钮获取中文摘要

EMAST腫瘍とその悪性度との相関性を基盤とした進行大腸癌悪性化機構の解明には、臨床をより精緻に再現するEMAST誘導条件を決め、その条件下でEMASTを示す細胞を分取して解析する必要がある。初年度は、培養細胞内でのEMAST発生を生きたまま検出できるレポーター細胞株の作製に着手し、完成まであと一歩である。作製過程で、当初に計画したレポーターの遺伝子構成を変更する必要性が浮上したため、以下に改良点を記載する。レポーター細胞株は、EMAST配列と蛍光タンパク質 (FP) 遺伝子から構成されるレポーターカセットをゲノムに組み込むことで作製する。レポーターカセットは蛍光タンパク質遺伝子の前にEMAST配列を配置することで、その配列長に応じて後続FP遺伝子の発現のオン・オフが決まる。バリエーションは、配列長に変化が生じれば発現がオンになるOut-of-frame to In-frame (O2I) 型と配列長の変化でオフになるIn-frame to Out-of-frame (I2O) 型とが考えられる。当初は、FP発現がオンとなることでEMASTを検出できるO2I型の方が細胞分取に有利と考えたが、現状のEMAST誘導条件が陽性率数％と低いことに鑑みると、I2O型の方がより広範なEMASTを検出でき感度が高くなるため適している。そこで、EMAST判定用のFPとしてGFP遺伝子を、また、レポーターカセット保有細胞の追跡用FPとしてVenus遺伝子を組み込んだレポーターカセットに改変した。また、I2O型でオフとなった際に明確に判定ができるよう、意図せぬ翻訳開始点からのFP漏出発現を極力抑えられるな工夫も加えてレポーター細胞株の作製を継続している。