風疹ウイルスレセプターの同定と体内伝播メカニズムの解明

风疹病毒受体的鉴定及内部传播机制的阐明

• 批准号: 22K09586
• 负责人: 森 嘉生
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: National Institute of Infectious Diseases
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K09586/
• 关键词: 風疹ウイルス; 膜融合; 侵入; スフィンゴミエリン; SMS1; エントリー; レセプター; 経胎盤感染; 先天性風疹症候群

風疹ウイルスの細胞侵入に関与する宿主因子を同定するため、ヒト胎盤絨毛癌細胞を用い、CRISPR/Cas9によるゲノムワイド遺伝子ノックアウトスクリーニングを実施した。その結果、SMS1が候補として同定された。SMS1はスフィンゴミエリン合成酵素であり、本ノックアウトにより細胞中のスフィンゴミエリン量が大幅に低下する。ヒト胎盤絨毛癌細胞JAR細胞ではSMSファミリーのうち、SMS1のみが発現している。本細胞ではSMS1のノックアウトにより風疹ウイルスの細胞侵入は検出されなくなるが、SMS1もしくはSMS2の過剰発現により侵入が回復した。HeLa細胞ではSMS1およびSMS2の両方が発現しているが、両方のノックアウトによって完全に風疹ウイルスの侵入が阻止された。このことはSMSファミリーは風疹ウイルス感染に冗長的に働いていることを示唆している。風疹ウイルス粒子のエンベロープを自己消光濃度の蛍光脂質でラベリングし、膜融合時のlipid mixingを検討したところ、SMS1ノックアウト細胞でもコントロール細胞と同様にlipid mixing自体は生じていた。しかし、その後のヌクレオキャプシドの放出過程を、ゲノムRNAのin situ hybridizationならびにE1タンパク質の蛍光抗体染色を用いて検討したところ、SMS1ノックアウト細胞では、ヌクレオキャプシドの細胞質への放出が認められなかった。このことは風疹ウイルスの完全な膜融合とヌクレオキャプシドの細胞質内への放出に宿主のスフィンゴミエリンが必須であることを示唆するものであった。スフィンゴミエリンによって風疹ウイルスの侵入が厳密に制御されていることから、SMSファミリーは風疹および先天性風疹症候群の治療の有用なターゲットになりうるものと考えられた。

为了鉴定风疹病毒细胞侵袭涉及的宿主因素，通过CRISPR/CAS9，使用人胎盘绒毛膜细胞进行了全基因组基因敲除筛查。结果，SMS1被确定为候选人。 SMS1是一种鞘磷脂合酶，这种敲除可显着减少细胞中鞘磷脂的量。在SMS家族中，仅SMS1在人胎盘绒毛膜瘤细胞细胞中表达。在此细胞中，SMS1的敲除可防止风疹病毒的细胞侵袭被检测到，但SMS1或SMS2的过表达恢复了入侵。 SMS1和SMS2均在HeLa细胞中表达，但两者都完全阻止了风疹病毒的进入。这表明SMS家族与风疹病毒感染有关。当将红宝石病毒颗粒的包络物与荧光浓度标记为荧光脂质，并在膜融合期间检查脂质混合，发现脂质混合本身在SMS1敲除细胞中发生，就像对照细胞一样。然而，使用基因组RNA和E1蛋白的荧光抗体染色的原位杂交研究了核素的随后释放，并且在SMS1基因敲除细胞中未观察到核素蛋白在细胞质中的释放。这表明宿主鞘磷脂对于风疹病毒的完整膜融合以及将核皮质释放到细胞质中至关重要。鞘磷脂严格调节风疹病毒的进入，使其成为治疗风疹和先天性风疹综合征的有用靶标。