フラビウイルス科ウイルスの複製・成熟に関する研究

黄病毒科病毒的复制和成熟研究

• 批准号: 03J03779
• 负责人: 森 嘉生
• 金额: $ 0.7万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-03J03779/
• 关键词: フラビウイルス; 日本脳炎ウイルス; コア蛋白質; 核移行シグナル; 複製; 成熟

日本脳炎ウイルス(JEV)を始めとしてフラビウイルスは細胞質内で複製するウイルスでありながら、その構造蛋白質の一つであるコア蛋白質が核内にも移行することが知られている。なぜウイルスがこのように無駄とも思えることを行っているのかを検討した。受入研究室においてこれまでにJEVコア蛋白質の核移行シグナル(NLS)が同定されている。すなわち、アミノ酸42および43位をアラニンに置換するとコア蛋白質の核移行が消失する。そこでまず、この変異をJEVAT31株の感染性cDNAクローンpMWJEATに導入したpMWJEAT/M4243を作製した。pMWJEATおよびpMWJEAT/M4243を鋳型にして合成した完全長のRNAをVero細胞にエレクトロポレーション法で導入し、培養上清中から野生型とNLS変異ウイルスを回収した。これらのウイルスを蚊由来C6/36細胞で継代増幅後、VeroおよびC6/36細胞での増殖性を検討した。変異ウイルスJEAT/M4243に導入したアミノ酸置換は、C6/36細胞で継代増幅後のウイルスでも保存されていた。また、コア蛋白質の特異抗体を用いた蛍光抗体法によって、野生型ウイルスのコア蛋白質は細胞質だけでなく核内にも局在するが、変異ウイルスのコア蛋白質は核内には局在しないことを確認した。変異ウイルスはVero細胞で、野生型ウイルスに比べて非常に小さなプラークを形成した。また、Vero細胞にMOI=5で両ウイルスを接種すると、変異ウイルスでは野生型ウイルスに比べて、培養上清中への感染性ウイルスの放出や感染細胞内でのウイルス蛋白質の産生が遅かった。一方、C6/36細胞では、このような遅延は認められなかった。以上のことからJEVはコア蛋白質を核移行させ、ウイルスの複製・成熟に有利な環境を作り出していることが推測された。

尽管包括日本脑炎病毒（JEV）在内的黄素病毒是在细胞质内复制的病毒，但众所周知，它们能够转移到核中，这是其结构蛋白之一。我们研究了为什么该病毒做这么浪费的事情。在宿主实验室已经确定了JEV核心蛋白的核转运信号（NLS）。也就是说，用丙氨酸代替氨基酸42和43将消除核心蛋白的核转运。因此，首先生产了PMWJeat/M4243，其中将该突变引入了菌株JEVAT31的传染性cDNA克隆PMWJeat。使用PMWJEAT和PMWJEAT/M4243合成的全长RNA作为模板通过电穿孔引入Vero细胞，并从培养上清液中收集了野生型和NLS突变病毒。这些病毒在蚊子来源的C6/36细胞中通过扩增，并研究了Vero和C6/36细胞中的增殖性能。在C6/36细胞中通过扩增后，引入突变病毒Jeat/M4243中引入的氨基酸取代也是该病毒的保守。此外，通过使用核心蛋白的特异性抗体的荧光抗体，我们证实了野生型病毒的核心蛋白不仅局部在细胞质中，而且在细胞核中也定位在核中，而且突变病毒的核心蛋白质不位于核中。突变病毒在Vero细胞中，与野生型病毒相比，该病毒形成非常小的斑块。此外，当Vero细胞以5个病毒为5的病毒接种时，突变病毒将传染性病毒释放到培养物上清液中，而感染细胞中病毒蛋白的产生比野生型病毒慢。另一方面，在C6/36细胞中未观察到这种延迟。从以上，可以推测JEV核传输核心蛋白质，并创建一个有利的环境，该环境对病毒的复制和成熟度有利。