光発芽種子の発芽のメカニズムに関する分子生物学的研究

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レタス種子の光発芽誘導は植物ホルモンの一つであるジベレリン(GA)を介していると考えられている.レタス種子は暗黒下においてもGA処理により暗発芽が誘導されるが,そのときに発現量が増加する遺伝子の一つとしてpLRG11がクローニングされている.pLRG11のインサートcDNAの長さは610bp程度(mRNAは約700b)で,5'側が100bp程欠除したcDNAであったが,その推定部分アミノ酸配列と高いホモロジーを示すタンパク質は現在までには知られていない.pLRG11のインサートcDNAはメチオニンコドンからはじまるが,そのメチオニンが翻訳開始点とは言えず,5'非コード領域を探索し翻訳開始点を決定することはpLRG11の機能解明には必須であるので,本研究ではその決定を目的とした.そこで,mRNAの塩基配列の一部がわかっているときに5'上流の未知領域をクローニングするための技術である5'RACEを試み,5'上流の未知配列を32塩基決定したが,その領域にもストップコドンが存在せず,翻訳開始点を明らかにすることはできなかった.5'RACEは本来500〜1000塩基の配列を容易に決定できる方法であるが,今回わずか32塩基しか決定できなかったのはmRNAからの逆転写が不完全であったためである.その原因としては,当該mRNAは5'側がループ構造などのように逆転写が進行しにくい立体構造をとりやすいという可能性が考えられる.逆転写反応前には65℃でmRNAを熱変性したが,45℃の反応中に再度構造が変化したのかもしれないので,高温下でも反応できる逆転写酵素を用いて再度試みる必要がある.また,種子,子葉,本葉,胚軸,根の試料を用いたノーザン分析では当該mRNAの発現は種子においてのみ検出できた.さらにゲノミックサザン分析によりこの遺伝子は1コピーであることが示唆された.