光発芽種子の発芽のメカニズムに関する分子生物学的研究

光发芽种子萌发机制的分子生物学研究

• 批准号: 08760110
• 负责人: 豊増 知伸
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: Yamagata University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08760110/
• 关键词: 光発芽; レタス種子; ジベレリン; 誘導遺伝子; cDNA塩基配列

レタス種子の光発芽誘導は植物ホルモンの一つであるジベレリン(GA)を介していると考えられている.レタス種子は暗黒下においてもGA処理により暗発芽が誘導されるが,そのときに発現量が増加する遺伝子の一つとしてpLRG11がクローニングされている.pLRG11のインサートcDNAの長さは610bp程度(mRNAは約700b)で,5'側が100bp程欠除したcDNAであったが,その推定部分アミノ酸配列と高いホモロジーを示すタンパク質は現在までには知られていない.pLRG11のインサートcDNAはメチオニンコドンからはじまるが,そのメチオニンが翻訳開始点とは言えず,5'非コード領域を探索し翻訳開始点を決定することはpLRG11の機能解明には必須であるので,本研究ではその決定を目的とした.そこで,mRNAの塩基配列の一部がわかっているときに5'上流の未知領域をクローニングするための技術である5'RACEを試み,5'上流の未知配列を32塩基決定したが,その領域にもストップコドンが存在せず,翻訳開始点を明らかにすることはできなかった.5'RACEは本来500〜1000塩基の配列を容易に決定できる方法であるが,今回わずか32塩基しか決定できなかったのはmRNAからの逆転写が不完全であったためである.その原因としては,当該mRNAは5'側がループ構造などのように逆転写が進行しにくい立体構造をとりやすいという可能性が考えられる.逆転写反応前には65℃でmRNAを熱変性したが,45℃の反応中に再度構造が変化したのかもしれないので,高温下でも反応できる逆転写酵素を用いて再度試みる必要がある.また,種子,子葉,本葉,胚軸,根の試料を用いたノーザン分析では当該mRNAの発現は種子においてのみ検出できた.さらにゲノミックサザン分析によりこの遺伝子は1コピーであることが示唆された.

据认为，生菜种子的诱导是由植物激素Gibberellin（GA）介导的。在黑暗中GA处理也诱导了生菜种子，但PLRG11被克隆为增加其表达水平的基因之一。 PLRG11的插入cDNA约为610 bp（mRNA约700 b），cDNA在5'侧丢失了约100 bp，其推定的部分氨基酸。迄今为止，与序列表现出很高同源性的蛋白质尚不清楚。 PLRG11的插入cDNA从蛋氨酸密码子开始，但蛋氨酸不是翻译起点，搜索5'非编码区域并确定翻译起始点对于阐明PLRG11的功能至关重要。因此，当已知mRNA的基本序列的一部分时，我们使用了一种在5'上游的未知区域克隆的技术。我们尝试了一个5'race，并确定了5'上游的未知序列，但是该区域没有停止密码子，并且无法揭示翻译起始点。 5'race最初是一种可以轻松确定500至1000个碱基的序列的方法，但是这次，只能确定32个基础，因为来自mRNA的逆转录不完整。这是因为5'侧的mRNA很难进行逆转录，例如环结构。 mRNA可能很容易构成。在逆转录反应之前，将mRNA在65°C下热变性，但是在45°C反应期间，结构可能再次发生变化，因此有必要再次使用逆转录酶再次尝试，即使在高温下也可以反应。此外，使用种子，子叶，真实叶子，下胚轴和根的样品进行北部分析，只能在种子中检测到mRNA的表达。此外，基因组南分析表明该基因是单个副本。