トリクロロエチレン分解細菌の構成的発現変異株の育種に関する研究

Pseudomonas putida BH株の有するフェノールヒドロキシラーゼは、トリクロロエチレン(TCE)を効果的に分解できるが、その発現はフェノールによる正の制御を受けるため、この酵素の誘導のためにフェノールが必須であった。そこで、本研究では、構成的にTCEを分解できる菌株を育種することを目的に、本菌株からクローニングしたフェノールヒドロキシラーゼ遺伝子(pheA)の制御遺伝子(pheR)を遺伝子工学的に改変し、構成的にフェノールヒドロキシラーゼを発現する変異株を構築することにした。まず、pheAの発現が構成的になるように、既報論文の知見から、pheR, pheA遺伝子を含む8.1kbのNotI DNA断片から、pheRの一部を欠失した遺伝子(ΔpheR)をPCR法によって増幅した。また、pheRタンパクのcis-acting領域を含むpheA遺伝子の増幅を行い、両者の増幅を電気泳動により確認した。次に、増幅した二つのDNA断片を結合させるため、両DNA断片を鋳型として、再度、PCRによる遺伝子の増幅を試みたが、ΔpheR, pheAを含むDNA断片の増幅には至らなかった。プライマーと種々条件をかけて、実験を試みたが、当該研究期間内にこのDNA分子の構築には成功しなかった。一方、得られた組換えDNA分子の土壌細菌の染色体埋め込みの予備試験として、広宿主域トランスポゾンベクターpUTKmをE. coli S17-1からP. putida KT2440株へ接合伝達で導入し、10^5/受容菌の頻度でカナマイシン耐性株を得た。ハイブリダイゼーションにより、耐性株の染色体にカナマイシン耐性遺伝子の埋め込みを確認した。今後、上記の組換えDNA分子が得られれば、この系を用いて構成的にTCE分解できる遺伝子を土壌細菌の染色体へ埋め込み、新規の有用TCE分解細菌を育種できると考えられる。

Pseudomonas putida BH株の有するフェノールヒドロキシラーゼは、トリクロロエチレン(TCE)を効果的に分解できるが、その発現はフェノールによる正の制御を受けるため、この酵素の誘導のためにフェノールが必須であった。そこで、本研究では、構成的にTCEを分解できる菌株を育種することを目的に、本菌株からクローニングしたフェノールヒドロキシラーゼ遺伝子(pheA)の制御遺伝子(pheR)を遺伝子工学的に改変し、構成的にフェノールヒドロキシラーゼを発現する変異株を構築することにした。まず、pheAの発現が構成的になるように、既報論文の知見から、pheR, pheA遺伝子を含む8.1kbのNotI DNA断片から、pheRの一部を欠失した遺伝子(ΔpheR)をPCR法によって増幅した。また、pheRタンパクのcis-acting領域を含むpheA遺伝子の増幅を行い、両者の増幅を電気泳動により確認した。次に、増幅した二つのDNA断片を結合させるため、両DNA断片を鋳型として、再度、PCRによる遺伝子の増幅を試みたが、ΔpheR, pheAを含むDNA断片の増幅には至らなかった。プライマーと種々条件をかけて、実験を試みたが、当該研究期間内にこのDNA分子の構築には成功しなかった。一方、得られた組換えDNA分子の土壌細菌の染色体埋め込みの予備試験として、広宿主域トランスポゾンベクターpUTKmをE. coli S17-1からP. putida KT2440株へ接合伝達で導入し、10^5/受容菌の頻度でカナマイシン耐性株を得た。ハイブリダイゼーションにより、耐性株の染色体にカナマイシン耐性遺伝子の埋め込みを確認した。今後、上記の組換えDNA分子が得られれば、この系を用いて構成的にTCE分解できる遺伝子を土壌細菌の染色体へ埋め込み、新規の有用TCE分解細菌を育種できると考えられる。