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配列選択的組込みにより安全な長期遺伝子発現を実現するトランスポゾンベクターの開発

开发通过序列选择性整合实现安全长期基因表达的转座子载体

基本信息

批准号：
11J01309
负责人：
中西秀之
金额：
$ 0.83万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2011
资助国家：
日本
起止时间：
2011 至 2012
项目状态：
已结题

项目摘要

ゲノムへの遺伝子組込みは、遺伝子治療やiPS細胞作製など、幅広く応用される。しかしながら、通常、組込み位置はランダムであるため、内在遺伝子付近への組込みにより、癌化等の変異を誘発する危険性がある。本研究ではこの危険性を低減するために組込み位置選択性を向上することを目的としている。前年度においては、標的配列を有するプラスミドDNAへの組込みにおいて、位置選択性を45倍向上可能であることを示した。しかしながら、遺伝子治療やips細胞作製においてはプラスミドDNAではなくゲノムに遺伝子を組込む必要があり、プラスミドDNAとゲノムではサイズや核内タンパク質との相互作用等に大きな違いがある。したがって、より厳密な評価のためには、組込み先のDNAとしてゲノムを用いて検討を行う必要があった。そこで本年度は、ゲノムへの組込みにおいて、位置選択性が向上可能であるかを検討した。細胞内へ導入したDNAを、配列選択的DNA結合タンパク質を用いてゲノム上の標的配列に固定した後、組込みを行う酵素であるphiC31インテグラーゼによって導入DNAをゲノムへ組込み、その組込み位置選択性を評価した。また、DNA結合タンパク質による標的配列への固定に十分な時間を検討するため、DNA結合タンパク質発現ベクター導入からphiC31インテグラーゼ発現ベクター導入までに1日または2日の時間差をおいた。加えて、組込まれるDNAを標的配列に固定するための、結合配列数が与える影響についても評価するため、0から66までの異なる数の結合配列をもつDNAを作製し、用いた。その結果、phiC31インテグラーゼ発現ベクター導入までの時間差が2日間、結合配列数4～18において、標的配列近傍への組込みが向上し、最大で対照群の26倍に達した。以上のように、本研究はゲノムへの組込みにおける位置選択性を大きく向上することに成功した。

Make sure that the sub-group is used to make sure that the sub-group is used, and that the iPS cell is used to make sure that the format is used in the first place. There are many diseases, such as cancer, cancer, cancer and other diseases, such as cancer, tissue cancer, cancer and so on. The purpose of this study is to select the location of the low-risk group and the target group. In the previous year, the arrangement of the previous year is that the location is 45 times higher than that of the previous year, and the location is 45 times more selective. it is possible that the location is 45 times higher. The ips cells were divided into two groups: the first one, the second group, the second group, the second group Please tell me that you need to DNA your information first. You will need to know if you need to. In the current year, the location option may be higher than that of the current year, and the location is optional. After the intracellular input of the DNA, the combination of the selected DNA and the configuration of the selected DNA, the enzyme was used to fix the DNA in the cell, and the location of the enzyme in the cell was selected. The arrangement of the telephone, the DNA and the combination of the two is fixed in 10 minutes, and the combination of the DNA and the DNA is used to realize that the data is not available on the first and the second day of the month. In addition, the combination of the number of fixed DNA, the number of matching columns, and the number of data in each column, and the number of data in each column, combined with the number of data in each column, combined with the number of data in each column, the combination of the number of fixed DNA, the number of matching columns, and the number of data in the configuration, the combination of the matching column and the combination of the number of data, and the number of data. According to the results of the test, the time difference between the two days of the purchase cycle, the number of combined columns, the number of neighboring clusters, and the maximum license group reached 26 times higher than that of 2 days later, the results of phiC31 experiments showed that the time difference between two days, the number of combined columns and the number of matching columns were 4: 18 and 26 times respectively. In this study, you will find that you can choose the location of your choice, and you will be successful.