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配列選択的組込みにより安全な長期遺伝子発現を実現するトランスポゾンベクターの開発

开发通过序列选择性整合实现安全长期基因表达的转座子载体

基本信息

批准号：
11J01309
负责人：
中西秀之
金额：
$ 0.83万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2011
资助国家：
日本
起止时间：
2011 至 2012
项目状态：
已结题

项目摘要

ゲノムへの遺伝子組込みは、遺伝子治療やiPS細胞作製など、幅広く応用される。しかしながら、通常、組込み位置はランダムであるため、内在遺伝子付近への組込みにより、癌化等の変異を誘発する危険性がある。本研究ではこの危険性を低減するために組込み位置選択性を向上することを目的としている。前年度においては、標的配列を有するプラスミドDNAへの組込みにおいて、位置選択性を45倍向上可能であることを示した。しかしながら、遺伝子治療やips細胞作製においてはプラスミドDNAではなくゲノムに遺伝子を組込む必要があり、プラスミドDNAとゲノムではサイズや核内タンパク質との相互作用等に大きな違いがある。したがって、より厳密な評価のためには、組込み先のDNAとしてゲノムを用いて検討を行う必要があった。そこで本年度は、ゲノムへの組込みにおいて、位置選択性が向上可能であるかを検討した。細胞内へ導入したDNAを、配列選択的DNA結合タンパク質を用いてゲノム上の標的配列に固定した後、組込みを行う酵素であるphiC31インテグラーゼによって導入DNAをゲノムへ組込み、その組込み位置選択性を評価した。また、DNA結合タンパク質による標的配列への固定に十分な時間を検討するため、DNA結合タンパク質発現ベクター導入からphiC31インテグラーゼ発現ベクター導入までに1日または2日の時間差をおいた。加えて、組込まれるDNAを標的配列に固定するための、結合配列数が与える影響についても評価するため、0から66までの異なる数の結合配列をもつDNAを作製し、用いた。その結果、phiC31インテグラーゼ発現ベクター導入までの時間差が2日間、結合配列数4～18において、標的配列近傍への組込みが向上し、最大で対照群の26倍に達した。以上のように、本研究はゲノムへの組込みにおける位置選択性を大きく向上することに成功した。

It is necessary to use the gene therapy and iPS cell production methods to improve the gene expression. In general, the position of the group is different from that of the group, and the risk of cancer is different from that of the group. This study aims to reduce the risk of disease and improve the quality of disease. In the past year, the target array has been selected, and the position selection is 45 times higher. The gene therapy system of ips is composed of DNA and DNA. The gene therapy system is composed of DNA and DNA. The gene therapy system is composed of DNA and DNA. It is necessary to conduct research on DNA in the past. This year, the company will be responsible for the management of the company. When DNA is introduced into the cell, the DNA-binding molecule with the selected alignment must be immobilized on the target alignment on the cell. After the target alignment is immobilized, the enzyme is used to perform the process. The phiC31 ™ technology can be used to introduce DNA into the cell. The selection of the location of the cell and the location of the cell are evaluated. The time difference between DNA binding and target alignment is 1 day and 2 days. Add, group, DNA target alignment, fixation, binding alignment, and evaluation, 66, binding alignment, DNA target alignment, preparation, and use. The results show that the time difference between phiC31 and phiC31 is 2 days, the number of combinations is 4~18, the number of combinations near the target is upward, and the maximum number of pairs is 26 times. The above results show that the study is successful in the selection of the group.