遺伝コードの拡張による人工機能非天然アミノ酸を含む超タンパク質の生合成

通过扩展遗传密码生物合成含有人工功能性非天然氨基酸的超级蛋白

• 批准号: 08751030
• 负责人: 芳坂 貴弘
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: Okayama University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08751030/
• 关键词: 非天然アミノ酸; 拡張遺伝コード; 超タンパク質; タンパク質生合成; 4塩基コドン; フレームシフトサプレッション; 人工機能; ストレプトアビジン

本研究では、種々の機能基を側鎖に有する非天然アミノ酸を含んだ人工タンパク質「超タンパク質」を合成することにより、種々の人工機能をタンパク質に与えることを目的としている。そのために、4塩基からなる遺伝コードとそれを読み取るtRNAを用いることで、タンパク質中に部位特異的に非天然アミノ酸を導入することを試みた。まず、ジヌクレオチドの3'末端に非天然アミノ酸の結合したアミノアシルジヌクレオチドを化学合成し、一方、4遺伝コドンを認識する塩基配列をもち、末端のジヌクレオチドを欠いたtRNAをT7RNAポリメラーゼを用いて合成した。この2つをT4RNAリガーゼを用いて連結し、非天然アミノ酸を担持したtRNAを合成した。また、ストレプトアビジンをコードし、特定部位に4遺伝コドンをもつmRNAを、T7RNAポリメラーゼにより合成した。これらを大腸菌のin vitroタンパク質合成系に加え、タンパク質の発現をウエスタンブロットにより検出した。その結果、AGG由来の4塩基コドン、AGGN(N=U,G,C,A)の他にも、CGG由来の4塩基コドン、CGGN(N=U,G,C,A)は全て非天然アミノ酸を導入することが可能であることが確認された。さらにストレプトアビジンの52位にAGGU、83位にCGGGを導入し、それぞれを読み取るtRNAにアンスリルアラニンとニトロフェニルアラニンを結合させておくことにより、独立に2つの非天然アミノ酸をタンパク質中の2カ所に導入することが可能であった。この手法を用いることにより、任意の2種類の機能基を特定部位に導入したタンパク質を設計・合成することが可能になるものと思われる。

In this study, the functional base of this research is a non-natural acid and an artificial acid containing "super タンパ"ク之　を综合することにより, kind of artificial function をタンパク性に and えることをpurpose としている.そのために、4塩组からなる伝コードとそれを読みtake るtRNAを用いるこThe non-natural aminic acid, which is specific to the に part of the とで and タンパク substances, is introduced into the することを trial.まず, ジヌクレオチドの3' terminal に non-natural アミノ acid の combination したアミノアシルジヌクレオチドを chemical synthesis し, one party, 4 leftovers The コドンを recognizes the する塩婩array をもち, the terminal のジヌクレオチドを owes いたtRNAをT7RNA ポリメラーゼを synthesizes した with いて.この2つをT4RNA リガーを is synthesized using いて linked し and non-natural アミノ acid を supported したtRNA を.また、ストレプトアビジンをコードし、specific parts に4缝コドンをもつmRNAを, T7RNAポリメラーゼによりsynthesisした.これらをEscherichia coli のin vitro タンパクstroma synthesis system に加え, タンパク色の発开をウエスタンブロットにより検出した. The result of その, the origin of AGG 4塩基コドン, AGGN (N=U,G,C,A)のhis にも, the origin of CGG 4塩基コドン、CGGN(N=U,G,C,A) is all non-natural amine acid and imported into it.さらにストレプトアビジンの52-bit AGGU, 83-bit CGGGをImportし、それぞれを読みtakeるtRNAにアンスリルアラニンとニトロフェニルアラニンを合させておくことにより, INDEPENDENT 2つの飞天However, it is possible to import the することが into the アミノ acid をタンパク中の2カSOに. The technique is guided by the いることにより, any 2 types of functional bases and specific parts. Into the design and composition of the material.

项目成果

Takahiro Hohsaka: "Incorporation of Nonnatural Amino Acids into Streptavidin through In Vitro Frameshift Suppression" Journal of the American Chemical Society. 118・40. 9778-9779 (1996)

Takahiro Hohsaka：“通过体外移码抑制将非天然氨基酸掺入链霉亲和素”美国化学会杂志 118・40（1996）。