2種類の機能基を精密空間配置した人工タンパク質の合成

两类官能团精确空间排列的人工蛋白质的合成

• 批准号: 12750783
• 负责人: 芳坂 貴弘
• 金额: $ 1.54万
• 依托单位: Okayama University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 2001
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-12750783/
• 关键词: 非天然アミノ酸; 人工タンパク質; 無細胞タンパク質合成; 4塩基コドン; 光誘起電子移動; 化学的アミノアシル化; 非天然変異法; フレームシフト; タンパク質生合成; ストレプトアビジン; ニトロフェニルアラニン; ナフチルアラニン

本研究では、タンパク質骨格を利用して2種類の人工機能基を精密に配置した全く新しい機能性高分子の合成を目的としている。まず、2種類の人工機能基をそれぞれ側鎖に有する2種類の非天然アミノ酸をタンパク質の特定部位へ導入する手法について検討を行なった。従来の4塩基コドンAGGUとCGGGを用いる方法では、あまり効率良く導入を行なうことが出来なかったため、新たな4塩基コドンの探索を行なった。新たに9種類の4塩基コドンについて検討した結果、グリシンのコドンGGGに1塩基付加したものが、非常に効率良く非天然アミノ酸の導入を行なえることがわかった。このうちの4塩基コドンGGGUとCGGGを2つ同時に使用することで、従来法に比べ約3倍の効率で、2種類の非天然アミノ酸を導入したタンパク質を合成することができた。この効率的な導入法を用いて、ストレプトアビジン中での電子ドナーから電子アクセプターへの光誘起電子移動反応について検討を行なった。まず、電子ドナーとなる非天然アミノ酸(アントラニル酸修飾ジアミノプロピオン酸)を合成し、ストレプトアビジンの様々な部位へ導入し、そのビオチン結合活性を確認した。結合活性が保持される、すなわち立体構造が保持される部位へ電子ドナーを導入しておき、さらにその近傍に電子アクセプターとしてニトロフェニルアラニンを導入した。それらの蛍光分析より、84位へ電子ドナー、54位へ電子アクセプターを導入した場合、約50%の蛍光消光が観察された。また52位へ電子ドナー、84位へ電子アクセプターを導入した場合は、約80%の蛍光消光が観察され、これらの部位間で効率的な電子移動が起きていることが示された。さらに、蛍光エネルギー移動のための非天然アミノ酸の合成とタンパク質への導入についても検討を行なった。

This study で は, タ ン パ ク bone cell を using し て 2 kinds の function of artificial base を precision に configuration し た く all new し い functional polymer の synthetic を purpose と し て い る. ま ず, 2 species の function of artificial base を そ れ ぞ れ side lock has す に る 2 kinds の unnatural ア ミ ノ acid を タ ン パ へ ク qualitative の particular part import す る gimmick に つ い て 検 line for を な っ た. 従 to の 4 salt base コ ド ン AGGU と CGGG を with い る method で は, あ ま り sharper rate good く import line を な う こ と が out な か っ た た め, new た な 4 salt base コ ド ン の exploration line を な っ た. New た に 9 kinds の 4 salt base コ ド ン に つ い て beg し 検 た results, グ リ シ ン の コ ド ン GGG に 1 salt base pay plus し た も の が, very に sharper rate good く unnatural ア ミ ノ acid の import line を な え る こ と が わ か っ た. こ の う ち の 4 salt base コ ド ン GGGU と CGGG を つ 2 at the same time use に す る こ と で, 従 to に about 3 times than べ の で working rate, 2 species の unnatural ア ミ ノ acid を import し た タ ン パ ク qualitative を synthetic す る こ と が で き た. を こ の sharper rate な import method with い て, ス ト レ プ ト ア ビ ジ ン in で の electronic ド ナ ー か ら electronic ア ク セ プ タ ー へ の light induced electronic mobile anti 応 に つ い て 検 line for を な っ た. ま ず, electronic ド ナ ー と な る unnatural ア ミ ノ acid (ア ン ト ラ ニ ル acid modified ジ ア ミ ノ プ ロ ピ オ ン acid) を synthetic し, ス ト レ プ ト ア ビ ジ ン の others 々 な parts へ import し, そ の ビ オ チ ン binding activity を confirm し た. Combined with active が keep さ れ る, す な わ ち three-dimensional structure が keep さ れ る parts へ electronic ド ナ ー を import し て お き, さ ら に そ の nearly alongside に electronic ア ク セ プ タ ー と し て ニ ト ロ フ ェ ニ ル ア ラ ニ ン を import し た. そ れ ら の 蛍 light analysis よ り, 84 へ electronic ド ナ ー, 54 へ electronic ア ク セ プ タ ー を import し た occasions, about 50% の 蛍 light extinction が 観 examine さ れ た. ま た 52 へ electronic ド ナ ー, 84 へ electronic ア ク セ プ タ ー を import し た は, about 80% の 蛍 light extinction が 観 examine さ れ, こ れ ら の で between body parts working rate な electronic mobile が き て い る こ と が shown さ れ た. さ ら に 蛍 light エ ネ ル ギ ー mobile の た め の unnatural ア ミ の ノ acid synthesis と タ ン パ ク qualitative へ の import に つ い て も 検 line for を な っ た.

项目成果

Takahiro Hohsaka, Yuki Ashizuka, Hikaru Taira, Hiroshi Murakami, Masahiko Sisido: "Incorporation of Nonnatural Amino Acids into Proteins by Using Various Four-Base Codons in an E. coli in vitro Translation System"Biochemistry. 40. 11060-11064 (2001)

Takahiro Hohsaka、Yuki Ashizuka、Hikaru Taira、Hiroshi Murakami、Masahiko Sisido：“在大肠杆菌体外翻译系统中使用各种四碱基密码子将非天然氨基酸掺入蛋白质中”生物化学。

Masumi Taki, Takahiro Hohsaka, Hiroshi Murakami, Kazunari Taira, Masahiko Sisido: "A Nonnatural Amino Acid for Efficient Incorporation into Proteins as a Sensitive Fluorescent Probe"FEBS Letters. 507. 35-38 (2001)

Masumi Taki、Takahiro Hohsaka、Hiroshi Murakami、Kazunari Taira、Masahiko Sisido：“一种作为敏感荧光探针有效掺入蛋白质的非天然氨基酸”FEBS 快报。