異常分泌タンパク質のペリプラズム生産に対する大腸菌のストレス応答の解析

大肠杆菌对异常分泌蛋白周质产生的应激反应分析

基本信息

批准号：
08760068
负责人：
門倉広
金额：
$ 0.64万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08760068/
关键词：
大腸菌ペリプラズムタンパク質分泌ストレス応答

项目摘要

これまでの実験ではストレスの原因となる、異種タンパク質のペリプラズムへの分泌生産の誘導は、アルカリ性ホスファターゼのプロモーターを利用して行っていた。これにはリン酸を含む培地から欠乏する培地への培地交換を必要とする。そこでより簡便に融合遺伝子の発現を誘導するため、強力でしかもIPTGによる制御が可能なtacプロモーターの下流に当該融合遺伝子を導入した。tacプロモーターから遺伝子発現を誘導したところこれまでのペリプラズムプロテアーゼDegPを欠損する大腸菌を宿主に用いた場合だけでなくdegP^+株を宿主とし場合にもPreS2のペリプラズムへの蓄積が認められた。この際これまでの3種類のタンパク質に加え48kDaのタンパク質が誘導合成を認めた。分子量およびDegP欠損株では誘導されないことからこの48kDaタンパク質はDegPであると予想された。そこでストレス下の大腸菌からmRNAを調製しノザン解析によりdegPmRNA量を調べたところその転写量は非ストレス下の大腸菌のものと比較し5倍から7倍に上昇していた。Prinston大のSilhavyらは、大腸菌外膜リポタンパク質NlpEの過剰生産によりDegPの発現が誘導されることを示している。そこでこの現象との比較を行うためにnlpEをtacプロモーターの下流にクローン化し、パルスチェイス実験をおこなったところNlpEそのものに加え既に報告のあるDegP(48kDa)とまだ未報告の37Kdaのタンパク質の発現量が顕著に上昇した。私の現象とDegP以外は異なるタンパク質が誘導されてくることから両者は異なる現象であると予想される。以上の経緯のように交付申請書作製時の34kDaタンパク質にかえ48kDaタンパク質の解析を行う結果となった。その結果、異種タンパク質のペリプラズム生産に伴いペリプラズムプロテアーゼDegPが誘導合成されることおよびこの誘導は転写レベルで行われることを明らかにした。

先前的实验是使用碱性磷酸酶的启动子进行的，以诱导异源蛋白的分泌产生，从而导致胁迫。这需要从含有磷酸盐的培养基到不足的培养基的培养基交换。因此，为了更容易诱导融合基因的表达，将融合基因引入了TAC启动子的下游，该基因很强，可以由IPTG控制。当从TAC启动子中诱导基因表达时，不仅将大肠杆菌（大肠杆菌）（缺乏亲本蛋白酶）用作宿主，而且当将DEGP^+菌株用作宿主时。在这种情况下，除了先前的三种蛋白质外，观察到48KDA蛋白是诱导的合成。预计该48KDA蛋白是DEGP，因为它未在分子量和DEGP缺陷菌株中诱导。因此，从应力的大肠杆菌中制备mRNA，并使用北方分析检查了DEGP mRNA的量，与非压力大肠杆菌相比，转录量从5倍增加到7倍。 Silhavy等。普林斯顿大学（Prinston University）表明，大肠杆菌外膜脂蛋白NLPE的过量生产会诱导DEGP表达。为了比较这种现象，将NLPE克隆为TAC启动子的下游，并进行了脉冲追逐实验，除了NLPE本身外，已经报道的DEGP（48 kDa）和仍未报告的37 kDa蛋白表达水平显着增加。由于除了我的现象和DEGP以外，还可以诱导不同的蛋白质，因此我可以期望它们是不同的现象。如上所述，在准备申请表时进行了结果以分析48KDA蛋白而不是34KDA蛋白。结果，揭示了周围蛋白酶DEGP与异源蛋白的周质产生一起诱导，并且这种诱导发生在转录水平。