植物のオルガネラ特異的ステロール輸送マシナリーの解析

本研究課題では、ERで作られるはずのステロールエステルがプラスチド由来のエライオプラストに蓄積するタペータム細胞に着目し、以下の２項目の実験により植物のオルガネラ間ステロール輸送機構の調査を計画している。１、エライオプラストへの輸送が起こるステップの推測これまでにステロール生合成などが異常となる変異体の葯を化学固定し、花粉の成熟過程でエライオプラストを含む脂質オルガネラの形態変化の違いを透過電子顕微鏡観察で見出してきている。化学固定は脂質の可視化に適している一方で、試料調整の過程でオルガネラの形の歪みなどの異常が生じる可能性がある。そこで、今年度は引き続き化学固定した葯の観察を進めるとともに、より生体内の状態に近いオルガネラ構造を観察出来るとされる、凍結固定を用いた観察も試みた。その結果、この固定法でも一部の変異体で脂質オルガネラの構造観察に成功した。化学固定では、良好な固定像を得ることが難しかった原色素体からエライオプラストの分化過程で、固定剤などの工夫によりERとの密接な接触が観察されてきている。凍結固定の結果と比較することで、エライオプラストの形成過程でERからどのように物質の輸送が行われるのか、明らかに出来るのではないかと期待している。２、ステロール生合成酵素が局在するオルガネラの特定タペータム生細胞で、ステロール生合成酵素がどのオルガネラに存在するのか調べるために、タペータム組織特異的に発現を誘導したステロール生合成酵素融合GFPなどを植物体に導入するためのベクター構築を行っている。今年度は、主なステロール生合成酵素の一つであるシクロアルテノール合成酵素mRNAの５‘末端配列を調べて、考えられうる最長の予測アミノ酸配列と開始コドンの位置を決定した。得られた情報を元にベクターを構築しており、シロイヌナズナに導入してGFP蛍光の細胞内局在を調べる予定である。

本研究課題では、ERで作られるはずのステロールエステルがプラスチド由来のエライオプラストに蓄積するタペータム細胞に着目し、以下の２項目の実験により植物のオルガネラ間ステロール輸送機構の調査を計画している。１、エライオプラストへの輸送が起こるステップの推測これまでにステロール生合成などが異常となる変異体の葯を化学固定し、花粉の成熟過程でエライオプラストを含む脂質オルガネラの形態変化の違いを透過電子顕微鏡観察で見出してきている。化学固定は脂質の可視化に適している一方で、試料調整の過程でオルガネラの形の歪みなどの異常が生じる可能性がある。そこで、今年度は引き続き化学固定した葯の観察を進めるとともに、より生体内の状態に近いオルガネラ構造を観察出来るとされる、凍結固定を用いた観察も試みた。その結果、この固定法でも一部の変異体で脂質オルガネラの構造観察に成功した。化学固定では、良好な固定像を得ることが難しかった原色素体からエライオプラストの分化過程で、固定剤などの工夫によりERとの密接な接触が観察されてきている。凍結固定の結果と比較することで、エライオプラストの形成過程でERからどのように物質の輸送が行われるのか、明らかに出来るのではないかと期待している。２、ステロール生合成酵素が局在するオルガネラの特定タペータム生細胞で、ステロール生合成酵素がどのオルガネラに存在するのか調べるために、タペータム組織特異的に発現を誘導したステロール生合成酵素融合GFPなどを植物体に導入するためのベクター構築を行っている。今年度は、主なステロール生合成酵素の一つであるシクロアルテノール合成酵素mRNAの５‘末端配列を調べて、考えられうる最長の予測アミノ酸配列と開始コドンの位置を決定した。得られた情報を元にベクターを構築しており、シロイヌナズナに導入してGFP蛍光の細胞内局在を調べる予定である。