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造血因子依存性細胞に造血支持細胞との直接接触によって発現誘導される遺伝子の検索

通过与造血支持细胞直接接触，寻找在造血因子依赖性细胞中诱导表达的基因

基本信息

批准号：
08740650
负责人：
杉本健吉
金额：
$ 0.58万
依托单位：
Niigata University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

研究計画では造血因子依存性細胞に造血支持細胞との直接接触によって誘導される未知の遺伝子を見つけるまで遂行する予定であったが、平成9年3月現在の状況はサブトラクション後のクローンをスクリーニングしている段階で、未知の遺伝子の発見には至っていない。研究の遅延の原因には以下のようなものがあった。1.サブトラクション後のcDNA増幅がうまくいかなかった。他社製品に比べて比較的安い耐熱性DNA合成酵素を汎用していたがうまく増幅できなかったため、Taq酵素への変更やその他のPCRコンディションを検討することにより、かなりの高分子のcDNAも増幅することが出来るようになった。2.サブトラクテッドcDNAのライブラリー構築が困難であった。通常のラムダファージベクターの組み込みは、何回かチャレンジしたがうまくいかなかった。そこでTA cloningを試みたがインサート含むクローンが極端に少なかった。残念ながら理由の解明には至っていない。そこで方法を変え制限酵素処理/脱リン酸化したベクターにインサートを組み込む基本的な方法によってインサートを持つクローンを幾つか得ることができた。3.実際の実験を遂行する上で幾つかの点の改良を試みた。1)サブトラクション時に共培養後のDA-1由来のcDNAから更にMS-5由来のcDNAを引く操作をつけ加え、共培養後のDA-1に特異的なcDNAの割合を高めた。2)サブトラクテッドクローンのノーザンハイブリダイゼーションによるスクリーニング操作を行い、大量クローンの処理に対応出来るようにした。今後の計画スクリーニング後ポジティブクローンを得たら、この遺伝子配列を決定し既知の遺伝子と同一であるかを検討すると共に、動物細胞発現ベクターにサブクローニングし、共培養前のDA-1細胞に組み込みその機能を調べる予定である。

Research plan: Hematopoietic factor-dependent cells, hematopoietic support cells, direct contact, induction, unknown, leftover, execution, implementation, scheduled, planned , the current situation in March 2009リーニングしている一stepで、Unknown の缝子の発见には～っていない. Research on the reason for the delay is as follows. 1. サブトラクション后のcDNA Amplification がうまくいかなかった. The heat-resistant DNA synthesis enzymes of other companies are compared with those made by other companies. no PCR PCRりのpolymer のcDNA も amp することがるようになった. 2. The difficulty of constructing the サブトラクテッドcDNAのライブラリー. Normally the のラムダファージベクターの组み込みは, and the かチャレンジしたがうまくいかなかった.そこでTA cloningをtrialみたがインサート用むクローンがextremeに小なかった. The explanation for the reason why I can't remember you is clear.そこで Method を変えRestricted enzyme treatment/de-nacidification したベクターにインサートをgroup み込むBasic way to do it is to get it right. 3. The improvement of the situation is a matter of practice. 1) The source of DA-1 cDNA after co-cultivation in Structural Science and Technology Co., Ltd. has been updated to the source of MS-5 The DNA was introduced and added, and the DA-1-specific cDNA was cut and combined after co-culture. 2)Surface The operation of スクリーニングを行い, the processing of large quantities of クローンのに対応出るようにした. Future plans are as follows:この缝子配をdeterminationしKnownの缝子と同同であるかを検 DiscussionすThe function of the DA-1 cells before co-cultivation and the function of the DA-1 cells before co-culture were determined.