オルガネラ膜接触部位の可視化蛍光プローブの創製および応用

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本研究では，近赤外蛍光特性をもつホスファローダミン色素(POR)について，その多機能化とオルガネラ膜接触部位可視化プローブへの展開に取り組んでいる．今年度は，極性応答PORの構造物性相関と細胞イメージングへの応用に取り組んだ．まず，末端アミノ基上のアルキル基の数を変換し，種々の誘導体を合成した．得られた色素群はいずれも中性緩衝液中で強い吸収・蛍光を示し，溶媒の極性環境に応答して分子内スピロ環化平衡に由来する蛍光のスイッチングが可能であった．また，アミノ基上のアルキル基が減少するに従い，吸収・蛍光波長が短波長シフトすること，スピロ環化平衡が閉環側へシフトすることを見出した．各色素に対し，ハロタグタンパク質に対するリガンドを連結することで，細胞内オルガネライメージングに適用可能とした．吸収・蛍光が短波長シフトした色素については，近赤外領域にてSTED顕微鏡を用いた超解像イメージングに応用させることにも成功した．さらに，これらの蛍光性リガンドはハロタグタンパク質に対する特異性が高く，発現量の低い細胞種でも効率的にオルガネラを標識できることが明らかになった．続いて，9位のアリール基の修飾を行なった．求核性置換基をカルボキシ基からスルホンアミド基に変換することで，スピロ環化平衡が大きく閉環側へシフトした．これに由来し，その蛍光性リガンドは細胞膜透過性の著しい向上が見られた．これにより低濃度条件での染色が可能となり，さらに近赤外領域の励起光を用いることで生理的環境でのイメージングに成功した．長時間イメージングの結果，細胞分裂中の細胞核の動態を追跡することにも成功した．以上の結果から，PORにおけるオルガネライメージングへの適用性だけでなく，波長や膜透過性といった，蛍光プローブとしての重要な特性を制御できることが明らかとなった．