ゲノム編集細胞の光学スクリーニングによる機能獲得型変異体ライブラリの迅速創出

通过基因组编辑细胞的光学筛选快速创建功能获得突变体库

• 批准号: 22KJ0572
• 负责人: Hu Xixun
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2023
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2023-03-08 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22KJ0572/
• 关键词: CRISPR imaging; CML; Ph chromosome; TKI resistance; CRISPR Imaging; genotyping; cell sorting

プロジェクト概要ゲノム変異はがんなどの疾患の原因の一つであるが、生きた細胞で特定のDNAを検出する技術がないため、研究が制限されている。そこで、CRISPRイメージングを用いて、生きた慢性骨髄性白血病細胞におけるPh染色体を可視化・定量化するプラットフォームを開発し、TKI治療に反応しない2xPh細胞の抵抗性を評価することで、CML患者の治療法開発に貢献することが期待される。この研究を完全に実行するために、私は研究計画を3つのステップに分けました。ステップ1：効果的なゲノム標識のためのRNPベースのCRISPRイメージングを開発する。ステップ2：CML細胞株におけるPh染色体の存在を確認する。ステップ3：2xPh細胞に対する薬剤スクリーニングを実施する。現在の状態ステップ1について：1年目は、RNPベースのCRISPRイメージングを開発しました。これは、dCas9融合体のタンパク質設計の最適化とCRISPRシグナルの最適な観察条件の決定を行った。これらの改善により、U2OS細胞においてChr13と19の検出率（CRISPRシグナルを含む細胞の割合）が約40%から90%へと大幅に向上しました。これらの結果から、本システムはPh染色体のマーカー遺伝子であるBCRとABLの標識にも有効である可能性が示唆されました。2年目には、dCas9-GFPとdCas9-RFPを同時に用いたマルチカラーラベリングシステムを開発しました。この進化により、BCRとABLの共局在を観察し、Ph染色体を特定することが可能になりました。これらの成果により、ステップ1は終了しました。ステップ2について：2年目には、U2OS細胞でCRISPRシグナルが頻繁に検出される、BCRとABL遺伝子を標識する特定の領域を特定しました。現在、このステップに取り組んでいます。

プ ロ ジ ェ ク ト profile ゲ ノ ム - different は が ん な ど の の disease causes a つ の で あ る が, raw き た cells で の specific DNA を 検 out す る technology が な い た め, research limitations が さ れ て い る. そ こ で, CRISPR イ メ ー ジ ン グ を with い て, raw き た chronic leukaemia of sex of bone marrow cells に お け る Ph chromosome を visualization, quantitative す る プ ラ ッ ト フ ォ ー ム を open 発 し, TKI treatment に 応 し な い 2 XPH cell の resistance を review 価 す る こ と で, patients with CML の therapy 発 に contribution す る こ と が expect さ れ る . The <s:1> <s:1> research を complete に implementation するために, private <s:1> research project を3 ステップに points けま た た. ス テ ッ プ 1: working fruit な ゲ ノ ム logo の た め の RNP ベ ー ス の CRISPR イ メ ー ジ ン グ を open 発 す る. Youdaoplaceholder0 2: The presence of <s:1> Ph chromosome in the CML cell line における is を confirmed する. Youdaoplaceholder0 3:2 xPh cells に against する drug ス リ リ ニ ニ グを グを グを administration する. Is in the state of の ス テ ッ プ 1 に つ い て : 1 year は, RNP ベ ー ス の CRISPR イ メ ー ジ ン グ を open 発 し ま し た. こ れ は, dCas9 fusion の タ ン パ の ク qualitative design optimization と CRISPR シ グ ナ ル の optimum な 観 examine condition の decision を line っ た. こ れ ら の improve に よ り, U2OS cell に お い て Chr13 と 19 の 検 rate (CRISPR シ グ ナ ル を) contain の む cells cut が about 40% か ら 90% へ と に sharply upward し ま し た. こ れ ら の results か ら, this シ ス テ ム は Ph chromosome の マ ー カ ー posthumous son 伝 で あ る BCR と ABL の logo に も have sharper で あ が る possibility in stopping さ れ ま し た. 2 years に は, dCas9 GFP と dCas9 - RFP を meanwhile に い た マ ル チ カ ラ ー ラ ベ リ ン グ シ ス テ ム を open 発 し ま し た. こ の evolution に よ り, BCR と ABL の total bureau in を 観 し, Ph chromosome specific す を る こ と が may に な り ま し た. The results are によ によ and ステップ1 によ. The final results are ま and た. ス テ ッ プ 2 に つ い て : 2 years に は, U2OS cell で CRISPR シ グ ナ ル が frequent に 検 out さ れ る, BCR と ABL heritage 伝 son を logo す る の particular area を specific し ま し た. Now, take the ステップに group んで んで ます ます.