ゲノム編集細胞の光学スクリーニングによる機能獲得型変異体ライブラリの迅速創出

通过基因组编辑细胞的光学筛选快速创建功能获得突变体库

• 批准号: 22KJ0572
• 负责人: Hu Xixun
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2023
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2023-03-08 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22KJ0572/
• 关键词: CRISPR imaging; CML; Ph chromosome; TKI resistance; CRISPR Imaging; genotyping; cell sorting

プロジェクト概要ゲノム変異はがんなどの疾患の原因の一つであるが、生きた細胞で特定のDNAを検出する技術がないため、研究が制限されている。そこで、CRISPRイメージングを用いて、生きた慢性骨髄性白血病細胞におけるPh染色体を可視化・定量化するプラットフォームを開発し、TKI治療に反応しない2xPh細胞の抵抗性を評価することで、CML患者の治療法開発に貢献することが期待される。この研究を完全に実行するために、私は研究計画を3つのステップに分けました。ステップ1：効果的なゲノム標識のためのRNPベースのCRISPRイメージングを開発する。ステップ2：CML細胞株におけるPh染色体の存在を確認する。ステップ3：2xPh細胞に対する薬剤スクリーニングを実施する。現在の状態ステップ1について：1年目は、RNPベースのCRISPRイメージングを開発しました。これは、dCas9融合体のタンパク質設計の最適化とCRISPRシグナルの最適な観察条件の決定を行った。これらの改善により、U2OS細胞においてChr13と19の検出率（CRISPRシグナルを含む細胞の割合）が約40%から90%へと大幅に向上しました。これらの結果から、本システムはPh染色体のマーカー遺伝子であるBCRとABLの標識にも有効である可能性が示唆されました。2年目には、dCas9-GFPとdCas9-RFPを同時に用いたマルチカラーラベリングシステムを開発しました。この進化により、BCRとABLの共局在を観察し、Ph染色体を特定することが可能になりました。これらの成果により、ステップ1は終了しました。ステップ2について：2年目には、U2OS細胞でCRISPRシグナルが頻繁に検出される、BCRとABL遺伝子を標識する特定の領域を特定しました。現在、このステップに取り組んでいます。

The main purpose of this study is to investigate the causes of various diseases and to identify the specific DNA in living cells. Therefore, we are looking forward to using the CRISPR information platform to develop a platform for visualizing and quantifying the Ph chromosome in newborn chronic osteoblastic leukemia cells, and to evaluate the resistance of 2xPh cells to TKI treatment, and to contribute to the development of treatments for CML patients. This research is fully implemented, and the private research project is divided into three parts. 1. The CRISPR information system is developed according to the requirements of the RNP. 2: Confirmation of the presence of Ph chromosomes in CML cell lines. 3: 2xPh cell phone calls Current status: 1 year old, RNP, CRISPR, development Optimization of quality design of dCas9 fusion and determination of optimal observation conditions for CRISPR The detection rate of U2OS cells in Chr13 and 19 increased significantly from about 40% to 90% The results of this study indicate that there is a possibility that BCR and ABL markers may be present in the Ph chromosome. In 2002, the development of dCas9-GFP and dCas9-RFP was launched. The evolution of BCR and ABL is under investigation, and Ph chromosome is under investigation. The results of this study are as follows: For example, CRISPR is frequently detected in U2OS cells, and BCR and ABL are identified in specific areas. Now, this is the first time I've ever been to a school.