δ型ホスホリパーゼCの構造と細胞内ターゲッティング

δ型磷脂酶C的结构和细胞内靶向

基本信息

  • 批准号:
    08680699
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 1.41万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    日本
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
  • 财政年份:
    1996
  • 资助国家:
    日本
  • 起止时间:
    1996 至 无数据
  • 项目状态:
    已结题

项目摘要

昨年までにPLC-δ1遺伝子ならびにその変異体の大腸菌発現系、酵母発現系および動物細胞発現系を確立する作業を行った。本年度はこれらの系を利用してin vitro, in vivoでの酵素活性と分子間相互作用の検討、また本酵素の構造と機能(特に細胞内機能)との関係についての詳細な検討を行った。(1) PLC-δ1の構造解析:(1)高純度のレコンビナントPLC-δ1を調整し、構造解析のための結晶化を試みた。幾つかの条件で微結晶が得られるようになったが、現在までにX線解析に興せられるような結晶は得られていない。(2)酵素活性がCa^<2+>依存性を持つことにより、本酵素のCa^<2+>結合部位を種々の欠失変異体を用いて解析した。その結果、本酵素には5〜6個のCa^<2+>結合部位があり、そのうち1〜2個はC端のC2領域に存在すること、またこの領域中の一部のアミノ酸置換により酵素活性が著明に低下することが判明した。我々がこれまでに解析したPH領域以外にも触媒活性の機能修飾部位が存在することが明らかになった。(3)他のいくつかのPH領域含有タンパクに対するモジュレーターとして知られるGタンパクβγサブユニットはin vitro, in vivoいずれの条件でもPLC-δ1と相互作用していることが明らかになった。(4)本酵素がセリン・スレオニン型キナーゼ、特にタンパクキナーゼCの基質になりうることがin vitroでのリン酸化実験により判明した。またin vivoリン酸化を行い、リン酸化がスレオニンにおこることを明らかにした。現在、リン酸化部位の特定と、細胞応答に伴うリン酸化の変動の有無を調べている。(2)無傷細胞におけるPLC-δ1の機能解析:培養細胞(MDCK, PC12)を使用し、PLC-δ1の局在性の変化を観察した。(1) MDCKにマイクロインジェクションによりPH領域変異体を導入し、免疫組織化学的に酵素の局在を調べることによって、PH領域の膜移行にN端37-43残基に含まれる4個の塩基性アミノ酸のそれぞれが決定的に重要であることを明らかにした。(2)内在性PLC-δ1をもつPC12に対し、IP3/PIP2結合領域(30-43)に相当する合成ペプチドを電気穿孔法により細胞内導入を行ったところ、この領域が細胞の形態維持に必要であることを示唆する結果を得た。
In the past year, the establishment of a recombinant Escherichia coli, yeast and animal cell development system was carried out. This year, we conducted a detailed study of the enzyme activity, molecular interaction, structure and function (especially intracellular function) of the enzyme in vitro and in vivo. (1)Structure analysis of PLC-δ1:(1) High purity of PLC-δ1, adjustment of PLC-δ1, structure analysis of PLC-δ1, crystallization of PLC-δ 1. A few conditions for micro-crystallization are obtained, and now X-ray analysis is obtained. (2)The Ca ^<2 +>-dependent enzyme activity was determined by analyzing the Ca^<2 +>-binding site of the enzyme. As a result, 5 ~ 6 Ca^<2+> binding sites of this enzyme were found, and 1 ~ 2 Ca ^<2 +> binding sites of this enzyme were found in the C-terminal C2 domain. The presence of catalytic activity and functional modification sites outside the PH domain is not a problem. (3)The PH domain contains the following conditions: in vitro, in vivo, PLC-δ1 interaction. (4)This enzyme is identified by the following methods: In vivo acidification, in vivo acidification Now, the specific site of acidification, cell response, accompanied by the presence or absence of acidification, is regulated. (2)Functional analysis of PLC-δ1 in non-injured cells: The use of cultured cells (MDCK, PC12) and the observation of the local transformation of PLC-δ1. (1)MDCK protein expression in the PH domain is regulated by enzyme activity in the N-terminal residues 37-43 of the PH domain, which is determined by four basic amino acids. (2)The intrinsic PLC-δ1 gene is linked to PC12, IP3/PIP2 and domain (30-43) is equivalent to synthetic selection by electroporation. The results are obtained by intracellular introduction, and the domain is necessary for cell morphology maintenance.

项目成果

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专著数量(0)
科研奖励数量(0)
会议论文数量(0)
专利数量(0)
Okutani, R. et al.: "Preparation and characterization of human recombinant protein 1/Clara cell 10-kDa protein." Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem.34. 691-696 (1996)
Okutani, R. 等人:“人重组蛋白 1/Clara 细胞 10-kDa 蛋白的制备和表征。”
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    0
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Kamata, H. et al.: "Nerve growth factor and forskolin prevent H202-induced apoptosis in PC12 cells by glutathione independent mechanism." Neuroscience letters.212. 179-182 (1996)
Kamata, H. 等人:“神经生长因子和毛喉素通过谷胱甘肽独立机制防止 H202 诱导的 PC12 细胞凋亡。”
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  • 发表时间:
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
  • 作者:
  • 通讯作者:
Kamata, H. et al.: "Suppression of NGF-induced neuronal differentiation of PC12 cells ; N-acetylcysteine (NAC) uncouples the signal transduction from Ras to the MAP kinase cascade." J. Biol. Chem.271. 33018-33025 (1996)
Kamata, H. 等人:“抑制 NGF 诱导的 PC12 细胞神经元分化;N-乙酰半胱氨酸 (NAC) 解偶联从 Ras 到 MAP 激酶级联的信号转导。”
  • DOI:
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    0
  • 作者:
  • 通讯作者:
Takeuchi, H. et al.: "Localization of a high affinity inositol 1, 4, 5-trisphosphate/inositol 1, 4, 5, 6-tetrakis-phosphate binding domain to the pleckstrin homology module of a new 130-kDa protein : Characterization of the determinants of structural spec
Takeuchi, H. 等人:“将高亲和力肌醇 1,4,5-三磷酸/肌醇 1,4,5,6-四磷酸结合域定位到新的 130-kDa 蛋白的 pleckstrin 同源模块:
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    0
  • 作者:
  • 通讯作者:
八木澤仁,豊島聰: "Neuroscience講座5「神経の情報伝達:理論と実際」,4章 ホスホリパーゼC" 廣川書店, 148 (1997)
八木泽仁、丰岛聪:《神经科学讲座 5“神经信息传递:理论与实践”,第 4 章磷脂酶 C》广川书店,148(1997)
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  • 通讯作者:
    八木澤 仁
イノシトールリン脂質結合タンパク質の脂質認識機構と膜結合による構造変化
肌醇磷脂结合蛋白的脂质识别机制以及膜结合引起的结构变化
  • DOI:
  • 发表时间:
    2003
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    八木澤 仁
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