Systematic shRNA and siRNA screens to investigate drug resistance in human leukemia

Z-Projekt hat zwei Ziele：首先是Klinischen Forschergruppe在我们的研究组中使用shRNA和siRNA筛选技术。该筛选基于两个复合物sh（短发夹）-RNA标记siRNA Bibliotheken。第一个图书馆是由Rene Bernards的研究小组设计的，他们沃登并收集了24,000个shRNA Vektoren，其中8,000个是人道基因。第二个“图书馆”是一个商业化的siRNA-Sammlung，包含23，000个siRNA寡核苷酸池;从这个图书馆我们有一个子图书馆，可以检测所有人的激酶和所有人的泛素-连接蛋白。在临床研究小组内部，韦尔登将建立一个siRNA-Bibliothek，所有的DNA修复和检查点蛋白质都是如此。这个图书馆有很多技术可以使用韦尔登。在我们的实验室里，我们使用了免疫荧光法，通过自动化的帮助，通过显微镜进行检查。Das tweite Ziel dieses Projektes besteht darin，Technology zu adaptieren，die es erlauben，nach Genen zu suchen，die für das Wachstum von leukämischen Stammzellen und die Entwicklung von Chemoresistenz essentiell sind.韦尔登我们将采用技术手段，在复杂的混合物中加入频率不同的shRNA载体。我们韦尔登通过慢病毒混合物治疗白血病Zellen，通过基因表达、感染和Zellen等，2006年）。这种筛选在贴壁细胞中进行时是相当容易的，并且仅限于含有多达1-2000个成员的基因家族，因为它们然后可以被移液。一个主要的优点是，这种klonocienen Assays und in Gegenwart von chemotherapeutischen Substanzen ausplattieren; langfristig ist geplant，infizierte Zellen zu in Scid-Mäuse zu transplantieren und therapienahe Protokolle durchzuführen.我们估计，为了使shRNA Vektoren能够选择性地表达，并通过基因表达的方式来完成韦尔登，这一过程并不简单。Ziel der ersten Förderperiode is es，einen“proof-of-principle”zu erhalten，der zeigt，dass es möglich ist，mit diesem Angly· Resistenzphänomene in Leukämiezellen zu analysieren.

Dieses Z-Projekt hat zwei Ziele: Erstens stellt es der Klinischen Forschergruppe zurzeit in unserer Gruppe verfügbare shRNA- und siRNA-abhängige Screening-Technologien zur Verfügung. Diese Screens basieren auf zwei komplexen sh(short hairpin)-RNA beziehungsweise siRNA Bibliotheken. Die erste Bibliothek ist am NKI von der Gruppe von Rene Bernards konstruiert worden und enthält annähernd 24,000 shRNA Vektoren, die gegen 8,000 humane Gene gerichtet sind. Die zweite „Bibliothek" ist eine kommerzielle siRNA-Sammlung mit insgesamt 23,000 einzelnen siRNA Oligonukleotidpools; aus dieser Bibliothek haben wir bereits Subbibliotheken, die gegen alle humanen Kinasen und alle humanen Ubiquitin-Ligasen enthalten, erstellt. Innerhalb der klinischen Forschergruppe werden wir entsprechend eine siRNA-Bibliothek, die gegen alle DNA-Reparatur- und Checkpointproteine gerichtet ist, erstellen. Diese Bibliotheken sind bereits mit mehreren Technologien durchsucht werden. Zum Beispiel haben wir mehrere Screens, die auf Immunfluoreszenz-Methoden basieren, mit Hilfe automatisierter, konfokaler Mikroskopie durchgeführt. Das zweite Ziel dieses Projektes besteht darin, Technologien zu adaptieren, die es erlauben, nach Genen zu suchen, die für das Wachstum von leukämischen Stammzellen und die Entwicklung von Chemoresistenz essentiell sind. Dazu werden wir Techniken adaptieren, die es erlauben, die Frequenz individueller shRNA Vektoren in komplexen Mischungen solcher Vektoren zu bestimmen. Wir werden dann leukämische Zellen mit Mischungen lentiviraler Vektoren, die jeweils eine shRNA gegen ein Gen exprimieren, infizieren, und die Zellen in et al., 2006). Such screens are fairly easy when they are performed in adherent cells and are limited to gene families hat contain up to 1-2000 members, since they can then be pipetted An alternative is to use retroviral or lentiviral libraries. One major advantage is that this klonocienen Assays und in Gegenwart von chemotherapeutischen Substanzen ausplattieren; langfristig ist geplant, infizierte Zellen zu in Scid-Mäuse zu transplantieren und therapienahe Protokolle durchzuführen. Anschließend werden wir bestimmen, für und gegen welche shRNA Vektoren während dieser Prozesse selektiert wird und daraus Rückschlüsse auf • diejenigen Gene ziehen, die für jeden Prozess notwendig sind. Ziel der ersten Förderperiode ist es, einen „proof-of-principle" zu erhalten, der zeigt, dass es möglich ist, mit diesem Ansatz • Resistenzphänomene in Leukämiezellen zu analysieren.