Systematic shRNA and siRNA screens to investigate drug resistance in human leukemia

[2] [2] [2] [2] [2] [2] [1] [1] [1] [1] [1] [1] [1] [1] [1] [1] [1] [1] [1] [1] [1] [1] [1] [1] [1] [1] [1] [1]Diese Screens basien auf zwei komplexen sh（短发夹）-RNA beziehungsweise siRNA Bibliotheken。Die erste Bibliothek ist am NKI von der Gruppe von Rene Bernards konstruiert worden and enthält annähernd 24,000 shRNA Vektoren, Die gegen 8,000 human Gene gerichtet sind。Die zweite " Bibliothek" ist eine kommerzielle siRNA- sammlung mit insgesamet 23000个siRNA寡核苷酸；【翻译】【翻译】【翻译】【翻译】【翻译】【翻译】【翻译】【翻译】【翻译】【翻译】Innerhalb der klinischen Forschergruppe werden ensprechendeine siRNA-Bibliothek， die gegen alle DNA-Reparatur and checkpoint蛋白基因图谱，[j]。《科学与技术》（Diese Bibliotheken）是《科学与技术》（mehren Technologien durchsucht werden）的缩写。Zum Beispiel hair, mehrere screen, die auf immunofluoreszenzenen - methoden basien, mit Hilfe automatisiter, konfokaler microskopie durchgefhrt。研究进展：研究进展，研究进展，研究进展，研究进展，研究进展，研究进展，研究进展，研究进展，研究进展，研究进展，研究进展，研究进展，研究进展，研究进展。大祖werden werden与Techniken adaptien， die es erlauen, die frequency individuler, shRNA vetoren in komplexen Mischungen solcher Vektoren zu beestimmen。Wir werden dann leukämische Zellen mit Mischungen lentiviraler Vektoren, die jewelry eine shRNA gegen in Gen exprieren, infizieren, and die Zellen in et al., 2006)。这种筛选在贴壁细胞中进行时相当容易，而且仅限于包含1-2000个成员的基因家族，因为它们可以被移液。另一种选择是使用逆转录病毒或慢病毒文库。一个主要的优点是，这种氯诺西宁检测方法和Gegenwart von chemotherapeutischen Substanzen ausplattieren；植物移植与治疗：植物移植与治疗：植物移植与治疗：植物移植与治疗Anschließend werden wir beestimmen, fr und gegen welche shRNA Vektoren während dieser Prozesse selektitit wind and daraus rckschl<e:1> sse auf•diejenigen Gene ziehen, die fr jeden prozessonendendig sin。Ziel der ersten Förderperiode ist es, einen " proof-of-principle" zu erhalten, der zet, pass es möglich ist, mit diesem Ansatz•Resistenzphänomene in Leukämiezellen zu analysieren。

Dieses Z-Projekt hat zwei Ziele: Erstens stellt es der Klinischen Forschergruppe zurzeit in unserer Gruppe verfügbare shRNA- und siRNA-abhängige Screening-Technologien zur Verfügung. Diese Screens basieren auf zwei komplexen sh(short hairpin)-RNA beziehungsweise siRNA Bibliotheken. Die erste Bibliothek ist am NKI von der Gruppe von Rene Bernards konstruiert worden und enthält annähernd 24,000 shRNA Vektoren, die gegen 8,000 humane Gene gerichtet sind. Die zweite „Bibliothek" ist eine kommerzielle siRNA-Sammlung mit insgesamt 23,000 einzelnen siRNA Oligonukleotidpools; aus dieser Bibliothek haben wir bereits Subbibliotheken, die gegen alle humanen Kinasen und alle humanen Ubiquitin-Ligasen enthalten, erstellt. Innerhalb der klinischen Forschergruppe werden wir entsprechend eine siRNA-Bibliothek, die gegen alle DNA-Reparatur- und Checkpointproteine gerichtet ist, erstellen. Diese Bibliotheken sind bereits mit mehreren Technologien durchsucht werden. Zum Beispiel haben wir mehrere Screens, die auf Immunfluoreszenz-Methoden basieren, mit Hilfe automatisierter, konfokaler Mikroskopie durchgeführt. Das zweite Ziel dieses Projektes besteht darin, Technologien zu adaptieren, die es erlauben, nach Genen zu suchen, die für das Wachstum von leukämischen Stammzellen und die Entwicklung von Chemoresistenz essentiell sind. Dazu werden wir Techniken adaptieren, die es erlauben, die Frequenz individueller shRNA Vektoren in komplexen Mischungen solcher Vektoren zu bestimmen. Wir werden dann leukämische Zellen mit Mischungen lentiviraler Vektoren, die jeweils eine shRNA gegen ein Gen exprimieren, infizieren, und die Zellen in et al., 2006). Such screens are fairly easy when they are performed in adherent cells and are limited to gene families hat contain up to 1-2000 members, since they can then be pipetted An alternative is to use retroviral or lentiviral libraries. One major advantage is that this klonocienen Assays und in Gegenwart von chemotherapeutischen Substanzen ausplattieren; langfristig ist geplant, infizierte Zellen zu in Scid-Mäuse zu transplantieren und therapienahe Protokolle durchzuführen. Anschließend werden wir bestimmen, für und gegen welche shRNA Vektoren während dieser Prozesse selektiert wird und daraus Rückschlüsse auf • diejenigen Gene ziehen, die für jeden Prozess notwendig sind. Ziel der ersten Förderperiode ist es, einen „proof-of-principle" zu erhalten, der zeigt, dass es möglich ist, mit diesem Ansatz • Resistenzphänomene in Leukämiezellen zu analysieren.