血球系転写因子NF−E2の活性調節機構の解析

マウス赤白血病細胞を用いた解析から、p45のN末端側83アミノ酸の領域内に転写活性化ドメインが存在することが明らかになった。そこで、本年度はこのドメインと直接結合しうる補助転写活性化因子の単離をYeast Two Hybridシステムを用いて試みた。まず、スクリーニングに際し標的として用いる領域を決定するため、p45のN末端側83アミノ酸の領域を1-83、1-36および39-83の各アミノ酸領域に分割し、それぞれとpGBT9プラスミドとの融合コンストラクトを作製した。それぞれの融合コンストラクトを酵母HF7cに遺伝子導入したところ、1-36アミノ酸領域を導入した場合のみヒスチジン(-)選択培地上で全くコロニー形成能を示さなかった。この結果から、1-36アミノ酸領域がスクリーニングの標的として最も適していると結論された。そこで次に、1-36アミノ酸領域とpGBT9との融合コンストラクトで形質転換された酵母HF7cを、マウス17日目杯由来cDNAライブラリーでさらに形質転換し、ヒスチジン要求性を指標に相互作用因子のスクリーニングを行った。第1回目のスクリーニングでは標的領域と結合しうる因子を最終的に得ることができなかったため、引き続き二回目のスクリーニングを行った。その結果、当初21個のコロニーがヒスチジン(-)選択培地より単離されたが、LacZ活性などを指標に陽性コロニーを数個まで絞り、現在それぞれのクローンについて塩基配列を決定している。今後は、得られた塩基配列を基に補助転写活性化因子としての可能性が高いと考えられるのを選択し、哺乳類の培養細胞を用いて標的領域との相互作用について確認する予定でいる。

マウス赤白血病細胞を用いた解析から、p45のN末端側83アミノ酸の領域内に転写活性化ドメインが存在することが明らかになった。そこで、本年度はこのドメインと直接結合しうる補助転写活性化因子の単離をYeast Two Hybridシステムを用いて試みた。まず、スクリーニングに際し標的として用いる領域を決定するため、p45のN末端側83アミノ酸の領域を1-83、1-36および39-83の各アミノ酸領域に分割し、それぞれとpGBT9プラスミドとの融合コンストラクトを作製した。それぞれの融合コンストラクトを酵母HF7cに遺伝子導入したところ、1-36アミノ酸領域を導入した場合のみヒスチジン(-)選択培地上で全くコロニー形成能を示さなかった。この結果から、1-36アミノ酸領域がスクリーニングの標的として最も適していると結論された。そこで次に、1-36アミノ酸領域とpGBT9との融合コンストラクトで形質転換された酵母HF7cを、マウス17日目杯由来cDNAライブラリーでさらに形質転換し、ヒスチジン要求性を指標に相互作用因子のスクリーニングを行った。第1回目のスクリーニングでは標的領域と結合しうる因子を最終的に得ることができなかったため、引き続き二回目のスクリーニングを行った。その結果、当初21個のコロニーがヒスチジン(-)選択培地より単離されたが、LacZ活性などを指標に陽性コロニーを数個まで絞り、現在それぞれのクローンについて塩基配列を決定している。今後は、得られた塩基配列を基に補助転写活性化因子としての可能性が高いと考えられるのを選択し、哺乳類の培養細胞を用いて標的領域との相互作用について確認する予定でいる。