Development of the GARAPON method for estimating the prevalence of antimicrobial resistance gene in each bacterial species in water environment

开发 GARAPON 方法来估计水环境中每种细菌中抗菌素耐药性基因的流行率

基本信息

批准号：
22K19848
负责人：
渡辺幸三
金额：
$ 4.16万
依托单位：
Ehime University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-06-30 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K19848/
关键词：
DNAメタバーコーディング薬剤耐性菌水環境

项目摘要

愛媛県内の２か所の下水処理場の流入下水・処理水、処理水の放流先の河川水・海水、養豚場排水とその処理水の各水サンプルを採取して実験室に持ち帰った。これらの水サンプルを採取した理由は、ガラポン法開発のためにはある程度の数と頻度で薬剤耐性遺伝子を有する細菌を用いることが望ましいため、抗菌剤などの使用量や残存濃度が高まって薬剤耐性遺伝子を有する細菌株が多いと想定されるこれらの水環境が適していると考えたためである。これら水サンプルを実験室内で無選択培養をして、最終的に５８６細菌株を単離培養をすることに成功した。これらの株からそれぞれ抽出したＤＮＡから16S rRNA遺伝子をＰＣＲ増幅し、サンガーシークエンシング法によりDNA配列を解読してからBLASTで細菌種名を同定した。また，日本国内で比較的検出されやすいと考えられる９種類の薬剤耐性遺伝子を解析対象に選定して、各細菌株における薬剤耐性遺伝子コピー数を定量するために必要となるプライマーを設計した。また、９種類中４種類については、上記の５８６細菌株から検出された薬剤耐性遺伝子のPCR産物を大クローニングして混合したポジティブコントロールを作成した。次に，上記５８６細菌株を混ぜ合わせた人工群集試料を作成した。この人工群集試料から、種構造（構成種と各種の細胞数）が大きく異なる多くの標本群集を数多く作成する手法を検討した。その結果、異なる孔径の複数のフィルターに水に混ぜた人工群集試料を通水することで、種構造が異なる標本群集を作る方針に決めた。

在ehime县，河水和海水中释放了经过处理的水，养猪场废水和经过处理的水，并收集了经过处理的水，收集了污水和海水的水样水样，并从那里释放了经过处理的水，并收集了处理过的水，并将其收集回实验室。收集这些水样品的原因是因为希望将细菌与耐药性基因一起以一定的数量和频率来开发Garapon方法，因此，这些水环境有望合适，其中有很多抗菌药物的量和残留浓度增加，并且有许多细菌菌株具有耐药基因的许多细菌菌株。这些水样在实验室中没有选择性地进行培养，最后，分离和培养了586种细菌菌株。从每种菌株中提取的DNA中扩增了16S rRNA基因，并通过sanger测序解码DNA序列，并使用BLAST鉴定了细菌种类的名称。此外，选择了九种类型的耐药性基因，这些耐药性基因被认为在日本相对易于检测，作为分析靶标，并且设计了量化每个细菌菌株中耐药性基因拷贝数所需的引物。此外，对于九种类型的四种，通过从上方的586个细菌菌株中检测到的耐药性基因的PCR产物的大量克隆制备了阳性对照，并将其混合。接下来，准备了一个人工群落样本，其中将上述586种细菌菌株混合在一起。我们研究了一种从该人工群落样本中创建许多具有较大物种结构（组成物种和各种细胞数量）的标本群落的方法。结果，我们决定通过通过多个孔径不同的过滤器将人工群落样品与水混合，以不同的物种结构来创建一个样本群落。