Development of the GARAPON method for estimating the prevalence of antimicrobial resistance gene in each bacterial species in water environment

开发 GARAPON 方法来估计水环境中每种细菌中抗菌素耐药性基因的流行率

• 批准号: 22K19848
• 负责人: 渡辺 幸三
• 金额: $ 4.16万
• 依托单位: Ehime University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-06-30 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K19848/
• 关键词: DNAメタバーコーディング; 薬剤耐性菌; 水環境

愛媛県内の２か所の下水処理場の流入下水・処理水、処理水の放流先の河川水・海水、養豚場排水とその処理水の各水サンプルを採取して実験室に持ち帰った。これらの水サンプルを採取した理由は、ガラポン法開発のためにはある程度の数と頻度で薬剤耐性遺伝子を有する細菌を用いることが望ましいため、抗菌剤などの使用量や残存濃度が高まって薬剤耐性遺伝子を有する細菌株が多いと想定されるこれらの水環境が適していると考えたためである。これら水サンプルを実験室内で無選択培養をして、最終的に５８６細菌株を単離培養をすることに成功した。これらの株からそれぞれ抽出したＤＮＡから16S rRNA遺伝子をＰＣＲ増幅し、サンガーシークエンシング法によりDNA配列を解読してからBLASTで細菌種名を同定した。また，日本国内で比較的検出されやすいと考えられる９種類の薬剤耐性遺伝子を解析対象に選定して、各細菌株における薬剤耐性遺伝子コピー数を定量するために必要となるプライマーを設計した。また、９種類中４種類については、上記の５８６細菌株から検出された薬剤耐性遺伝子のPCR産物を大クローニングして混合したポジティブコントロールを作成した。次に，上記５８６細菌株を混ぜ合わせた人工群集試料を作成した。この人工群集試料から、種構造（構成種と各種の細胞数）が大きく異なる多くの標本群集を数多く作成する手法を検討した。その結果、異なる孔径の複数のフィルターに水に混ぜた人工群集試料を通水することで、種構造が異なる標本群集を作る方針に決めた。

The sewage treatment plant in Ehime Prefecture has a water treatment room for all kinds of water, such as inflow sewage, treated water, discharge of treated water, river water, seawater and pig farm drainage. The reason for the adoption of this method is that the number and frequency of bacteria with resistance to antibiotics are high, and the concentration of bacteria with resistance to antibiotics is high. The results showed that 586 bacteria strains were successfully cultured in vitro. The DNA sequence of these strains was amplified by PCR and sequenced by BLAST. In addition, the number of resistant genes of 9 kinds of bacteria in Japan was selected and quantified. In addition, PCR products from 4 of the 9 species and the drug-resistant genes detected from the 586 bacterial strains mentioned above were mixed with large quantities of additives to produce the desired product. 586 bacterial strains were mixed and artificial colony samples were prepared. This artificial cluster sample, species structure (constituent species and various cell numbers) vary greatly from one species to another, and the number of species clusters is varied from one species to another. The results show that there are a number of different pore sizes in the water, artificial clustering samples in the water, and different structures in the water.

项目成果

異なる環境条件での薬剤耐性遺伝子の伝達率の比較：個体群動態モデルの適用

不同环境条件下耐药基因传播率比较：群体动力学模型的应用

• 发表时间: 2023
• 作者: 植田亮太;三浦郁修;阪本愛;門屋綾;鈴木聡;渡辺幸三
• 通讯作者: 渡辺幸三