Development of the GARAPON method for estimating the prevalence of antimicrobial resistance gene in each bacterial species in water environment

愛媛県内の２か所の下水処理場の流入下水・処理水、処理水の放流先の河川水・海水、養豚場排水とその処理水の各水サンプルを採取して実験室に持ち帰った。これらの水サンプルを採取した理由は、ガラポン法開発のためにはある程度の数と頻度で薬剤耐性遺伝子を有する細菌を用いることが望ましいため、抗菌剤などの使用量や残存濃度が高まって薬剤耐性遺伝子を有する細菌株が多いと想定されるこれらの水環境が適していると考えたためである。これら水サンプルを実験室内で無選択培養をして、最終的に５８６細菌株を単離培養をすることに成功した。これらの株からそれぞれ抽出したＤＮＡから16S rRNA遺伝子をＰＣＲ増幅し、サンガーシークエンシング法によりDNA配列を解読してからBLASTで細菌種名を同定した。また，日本国内で比較的検出されやすいと考えられる９種類の薬剤耐性遺伝子を解析対象に選定して、各細菌株における薬剤耐性遺伝子コピー数を定量するために必要となるプライマーを設計した。また、９種類中４種類については、上記の５８６細菌株から検出された薬剤耐性遺伝子のPCR産物を大クローニングして混合したポジティブコントロールを作成した。次に，上記５８６細菌株を混ぜ合わせた人工群集試料を作成した。この人工群集試料から、種構造（構成種と各種の細胞数）が大きく異なる多くの標本群集を数多く作成する手法を検討した。その結果、異なる孔径の複数のフィルターに水に混ぜた人工群集試料を通水することで、種構造が異なる標本群集を作る方針に決めた。

愛媛県内の２か所の下水処理場の流入下水・処理水、処理水の放流先の河川水・海水、養豚場排水とその処理水の各水サンプルを採取して実験室に持ち帰った。これらの水サンプルを採取した理由は、ガラポン法開発のためにはある程度の数と頻度で薬剤耐性遺伝子を有する細菌を用いることが望ましいため、抗菌剤などの使用量や残存濃度が高まって薬剤耐性遺伝子を有する細菌株が多いと想定されるこれらの水環境が適していると考えたためである。これら水サンプルを実験室内で無選択培養をして、最終的に５８６細菌株を単離培養をすることに成功した。これらの株からそれぞれ抽出したＤＮＡから16S rRNA遺伝子をＰＣＲ増幅し、サンガーシークエンシング法によりDNA配列を解読してからBLASTで細菌種名を同定した。また，日本国内で比較的検出されやすいと考えられる９種類の薬剤耐性遺伝子を解析対象に選定して、各細菌株における薬剤耐性遺伝子コピー数を定量するために必要となるプライマーを設計した。また、９種類中４種類については、上記の５８６細菌株から検出された薬剤耐性遺伝子のPCR産物を大クローニングして混合したポジティブコントロールを作成した。次に，上記５８６細菌株を混ぜ合わせた人工群集試料を作成した。この人工群集試料から、種構造（構成種と各種の細胞数）が大きく異なる多くの標本群集を数多く作成する手法を検討した。その結果、異なる孔径の複数のフィルターに水に混ぜた人工群集試料を通水することで、種構造が異なる標本群集を作る方針に決めた。