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生体脳での軸索起始部の観察と操作を可能にする技術基盤の確立

建立能够观察和操纵活体大脑中轴突起源的技术平台

基本信息

批准号：
22K19358
负责人：
久場博司
金额：
$ 4.16万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-06-30 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K19358/
关键词：
軸索ゲノム編集可視化操作

项目摘要

軸索起始部（AIS）可塑性は、脳の機能や病態を決定する上で中核的な役割を担うと考えられる。しかしながら、その回路・個体レベルでの意義に対する理解は進んでいない。この主な理由として、現在のAIS研究では同一細胞でのAIS分布の継時変化を評価することが困難なことが挙げられる。本研究では、生体脳においてAIS分布を連続的に観察する技術と人為的に操作するための技術基盤を確立する。本年度はAIS局在分子標識によるAIS可視化ツールの構築を目指した。標識分子の過剰発現では分子がAIS外に逸脱し、AISのみの可視化は困難である。従って、ゲノム編集を用いたノックインによる内在性蛋白質標識（SLENDR法）を行うことで、AISに高密度で局在することが知られる電位依存性Naチャネル（Nav1.6）とその足場タンパク質（ankyrinG）の標識を試みた。具体的には、これら分子のC末にHA-tag配列を挿入するよう設計されたplasmidベクターを電気穿孔法によりニワトリ脳幹の聴覚神経細胞へ導入し、組織固定後に抗体染色を行うことでAISの可視化を行った。その結果、ankyrinGの標識ではAISが確認できたものの、導入効率が低く、かつNav1.6の信号は確認することができなかった。従って、さらにこれらの改善を試みた。まず、導入効率を高めるために、Cas9タンパク質とgRNAを試験管内で複合体形成させたものを電気穿孔法で導入する方法（eCHIKIN法）を試みたところ、導入細胞を大幅に増やすことができた。次に、信号強度を高めるために、挿入するHA-tagを従来の1つから4つに増やしたところ、信号強度が大幅に増強し、Nav1.6の信号を確認することができた。一方、HA-tagの増加による導入効率の低下は見られなかった。

Axle initiation (AIS) plasticity, function, and pathologies are determined by the presence of a central component. To understand the meaning of the individual, the individual should be aware of the meaning of the individual. The main reason for this is that it is difficult to evaluate the temporal variation of AIS distribution in the same cell. This study aims to establish the technical basis for the observation of the distribution of AIS in organisms. This year, AIS Bureau has been focusing on molecular identification and AIS visualization. The identification of molecules is difficult to visualize and escape from AIS. The intrinsic protein labeling (SLENDR) method is used to identify the potential dependent protein (Nav1.6) in AIS and high density. The specific HA-tag alignment of these molecules was designed for plasmid-based electroporation, and antibody staining was performed after tissue fixation. The result is that the ankyrin G logo is not recognized by AIS, the import efficiency is low, and the Nav1.6 signal is not recognized by AIS.従って、さらにこれらの改善を试みた。The introduction rate of Cas9 in vitro was significantly increased by electroporation (eCHIKIN). Second, the signal strength is higher, the HA-tag is higher, the signal strength is higher, and the Nav1.6 signal is higher. A party, HA-tag increase in the introduction rate of low, but also see the rise in the number of