cell free mRNAからの微量遺伝子変異検出法の確立とその応用

血中を循環するcell free DNA(cfDNA)に含まれる腫瘍由来の変異遺伝子の情報は、一部の進行がんへの投薬判定（コンパニオン診断）や再発モニタリングに利用されている。しかし、腫瘍由来のcfDNAが占める割合はごく僅かであり、感度不足の克服は継続的な課題となっている。 感度不足を補う方法として、最近では血中を循環するmRNA(cell free mRNA)の診断への利用が検討されている。しかし、cf-mRNAの存在様式（一本鎖、多様な塩基長、二次構造、細胞外小胞・極小顆粒内など）はcfDNAとは大きく異なり、検出・評価手法はまだ十分に確立されていない。本研究では、cf-mRNAの回収方法の検討、プライマー・プローブ設計の改良、逆転写・増幅酵素の比較検討、PCR条件の至適化など、cf-mRNAから微量遺伝子変異を検出するための一連のプロセスの最適化を行う。今年度は、細胞外放出mRNAを効率的に回収するための方法に関する文献調査、高感度に検出する上で適切な酵素類（逆転写酵素，ポリメラーゼ）について調査を行い、最適と考えられる試薬類を選定した。また、プライマーの設計方法の調査と実際に設計されたプライマー群の品質についてSYBR green法にて確認を行い、最適なパフォーマンスが期待できるプライマーの選別方法を確立した。上記と関連し、臨床検体から標的核酸配列を検出するための様々な核酸増幅検査薬に関して、それらの検出原理、逆転写酵素、ポリメラーゼ、内部標準核酸、検体処理方法、判定方法、試薬構成、測定機器など一連の調査研究を行い、その成果の一部について原著論文として医薬品医療機器レギュラトリーサイエンス誌に報告した。

血中を循環するcell free DNA(cfDNA)に含まれる腫瘍由来の変異遺伝子の情報は、一部の進行がんへの投薬判定（コンパニオン診断）や再発モニタリングに利用されている。しかし、腫瘍由来のcfDNAが占める割合はごく僅かであり、感度不足の克服は継続的な課題となっている。 感度不足を補う方法として、最近では血中を循環するmRNA(cell free mRNA)の診断への利用が検討されている。しかし、cf-mRNAの存在様式（一本鎖、多様な塩基長、二次構造、細胞外小胞・極小顆粒内など）はcfDNAとは大きく異なり、検出・評価手法はまだ十分に確立されていない。本研究では、cf-mRNAの回収方法の検討、プライマー・プローブ設計の改良、逆転写・増幅酵素の比較検討、PCR条件の至適化など、cf-mRNAから微量遺伝子変異を検出するための一連のプロセスの最適化を行う。今年度は、細胞外放出mRNAを効率的に回収するための方法に関する文献調査、高感度に検出する上で適切な酵素類（逆転写酵素，ポリメラーゼ）について調査を行い、最適と考えられる試薬類を選定した。また、プライマーの設計方法の調査と実際に設計されたプライマー群の品質についてSYBR green法にて確認を行い、最適なパフォーマンスが期待できるプライマーの選別方法を確立した。上記と関連し、臨床検体から標的核酸配列を検出するための様々な核酸増幅検査薬に関して、それらの検出原理、逆転写酵素、ポリメラーゼ、内部標準核酸、検体処理方法、判定方法、試薬構成、測定機器など一連の調査研究を行い、その成果の一部について原著論文として医薬品医療機器レギュラトリーサイエンス誌に報告した。