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cell free mRNAからの微量遺伝子変異検出法の確立とその応用

无细胞mRNA检测微量基因突变方法的建立及其应用

基本信息

批准号：
22K12899
负责人：
築茂由則
金额：
$ 2.75万
依托单位：
National Institute of Health Sciences
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K12899/
关键词：
cfRNA cfDNA exosome cell free RNA コンパニオン診断がんエクソソーム EGFR

项目摘要

血中を循環するcell free DNA(cfDNA)に含まれる腫瘍由来の変異遺伝子の情報は、一部の進行がんへの投薬判定（コンパニオン診断）や再発モニタリングに利用されている。しかし、腫瘍由来のcfDNAが占める割合はごく僅かであり、感度不足の克服は継続的な課題となっている。感度不足を補う方法として、最近では血中を循環するmRNA(cell free mRNA)の診断への利用が検討されている。しかし、cf-mRNAの存在様式（一本鎖、多様な塩基長、二次構造、細胞外小胞・極小顆粒内など）はcfDNAとは大きく異なり、検出・評価手法はまだ十分に確立されていない。本研究では、cf-mRNAの回収方法の検討、プライマー・プローブ設計の改良、逆転写・増幅酵素の比較検討、PCR条件の至適化など、cf-mRNAから微量遺伝子変異を検出するための一連のプロセスの最適化を行う。今年度は、細胞外放出mRNAを効率的に回収するための方法に関する文献調査、高感度に検出する上で適切な酵素類（逆転写酵素，ポリメラーゼ）について調査を行い、最適と考えられる試薬類を選定した。また、プライマーの設計方法の調査と実際に設計されたプライマー群の品質についてSYBR green法にて確認を行い、最適なパフォーマンスが期待できるプライマーの選別方法を確立した。上記と関連し、臨床検体から標的核酸配列を検出するための様々な核酸増幅検査薬に関して、それらの検出原理、逆転写酵素、ポリメラーゼ、内部標準核酸、検体処理方法、判定方法、試薬構成、測定機器など一連の調査研究を行い、その成果の一部について原著論文として医薬品医療機器レギュラトリーサイエンス誌に報告した。

The circulating cell free DNA(cfDNA) in the blood contains information about the origin of the tumor, and part of the process is used to determine the dosage (diagnosis) and regeneration of the tumor. The problem of how to overcome the deficiency of sensitivity is that cfDNA is the source of cancer. Methods for detecting deficiency in sensitivity have recently been discussed for the use of circulating cell free mRNA in diagnosis. The existence of cf-mRNA (one-dimensional, multi-dimensional, two-dimensional, extracellular, and intragranular) is very well established in the context of cfDNA and large differences, detection, and evaluation methods. This study is aimed at the review of cf-mRNA retrieval methods, improvement of amplification design, comparative review of amplification enzymes, optimization of PCR conditions, detection of cf-mRNA micro-amplification differences, and optimization of the sequence of amplification methods. This year, the method of extracellular mRNA release is reviewed, and the appropriate enzyme type (reverse transcription enzyme) is selected. The investigation of design method of the film and the quality of the film and the selection method of the film are established. The above notes are related to the detection of nucleic acid alignment in clinical samples, related to the detection of nucleic acid amplification, detection principles, reverse transcription enzymes, detection methods, internal standard nucleic acids, sample processing methods, determination methods, test composition, measurement equipment, investigation research, and part of the results of original papers, medical products and medical equipment.