老化細胞誘発クラスター性変異のNGS解析による放射線発がん機構研究

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様々な条件下においてヒト細胞でDNAに誘発される変異誘発の頻度と変異スペクトルを解析することが可能な実験系の開発を行った。pNGS2 Barcode pDNA Library（NGSのSequencingエラーをBarcode解析で除くことが可能なsupF plasmid DNA library）を設計構築した。まず、DNA損傷による変異シグネチャーが特徴的な紫外線照射を用いた解析を行うことで新しい変異解析法としての検証研究を行った。また、その実験データから、新しい紫外線の変異シグネチャーを見出した（Kawai H., et al., eLife., 11:e83780 (2022))。次に、開発した方法を用い、Cs-137ガンマ線の持続照射条件下での変異解析を行った。構築したpDNA Libraryをヒト培養細胞に導入し、Cs-137ガンマ線の持続照射条件下（0, 1, 2 Gy/day）で、2日間培養した。細胞から抽出したpDNA Libraryについて、指示大腸菌株を用いて、変異誘発頻度をコロニーカウントで、変異スペクトルをNGS解析によって行った。更に、指示大腸菌を用いることなく、変異頻度と変異スペクトル解析を行ったところ、それぞれの実験において、ほぼ同程度の変異体頻度（10の-6乗bpオーダー）で、変異スペクトルが得られた。これらの実験結果から、指示大腸菌を用いることなく、高感度に変異スペクトル解析が可能であることが明らかとなった。また、行った実験結果から、現在用いているpDNA Libraryでは、解析配列の偏りが、変異シグネチャー解析する上で問題となる可能性が示唆された。そのため、新たに解析配列に偏りのないpDNA Libraryの開発を行うこととした。