Regulation of oncogenic RAS-induced endoplasmic reticulum stress response by zinc signaling

本年度は、まず、RASシグナルによる小胞体ストレスセンサー分子IRE1の活性化と、それに対する細胞内亜鉛の影響を検討した。活性型変異体Hras（HrasG12V）を誘導発現するラット胎児線維芽細胞株Rat-1細胞由来の細胞（Rat-1RasVal細胞）において、IRE1活性化依存的なXbp1の非定型スプライシングがHrasG12V発現により誘導されることを確認した。また、HrasG12V発現によりIRE1のタンパク質の量が増加することも見出した。これらHrasG12V発現が引き起こすIRE1の変化は、MEK/ERK経路を介していることを阻害剤実験で明らかにした。そこで、IRE1の活性と相関し得るリン酸化の検出をphostag法で試みたところ、HrasG12V発現でIRE1のリン酸化が著しく亢進することがわかった。しかし、当初期待した亜鉛依存的なリン酸化については、phostag法の条件を様々に変えてはみたが現時点では検出されていない。またIRE1タンパク質の量の増加についても、プロテアソーム阻害剤などを用いて検討したが、HrasG12V発現や亜鉛濃度による影響は観察されなかった。そこで方針を変え、HrasG12V誘導発現や亜鉛欠乏による細胞死応答が生じないマウス胎児線維芽細胞株3T3細胞由来の細胞（3T3RasVal細胞）で、同様の解析を試みた。その結果、3T3RasVal細胞では、HrasG12V発現ではIRE1活性化依存的なXbp1の非定型スプライシングが誘導されないことがわかった。以上から、HrasG12VによるMEK/ERK依存的IRE1活性化には、Rat-1にはあるが3T3にはない機構が関与すると考えられた。また、Rat-1RasVal細胞を用いた解析の過程で、培地への亜鉛添加とHrasG12V発現とに依存して変化する新たなシグナル系を見出した。

本年度は、まず、RASシグナルによる小胞体ストレスセンサー分子IRE1の活性化と、それに対する細胞内亜鉛の影響を検討した。活性型変異体Hras（HrasG12V）を誘導発現するラット胎児線維芽細胞株Rat-1細胞由来の細胞（Rat-1RasVal細胞）において、IRE1活性化依存的なXbp1の非定型スプライシングがHrasG12V発現により誘導されることを確認した。また、HrasG12V発現によりIRE1のタンパク質の量が増加することも見出した。これらHrasG12V発現が引き起こすIRE1の変化は、MEK/ERK経路を介していることを阻害剤実験で明らかにした。そこで、IRE1の活性と相関し得るリン酸化の検出をphostag法で試みたところ、HrasG12V発現でIRE1のリン酸化が著しく亢進することがわかった。しかし、当初期待した亜鉛依存的なリン酸化については、phostag法の条件を様々に変えてはみたが現時点では検出されていない。またIRE1タンパク質の量の増加についても、プロテアソーム阻害剤などを用いて検討したが、HrasG12V発現や亜鉛濃度による影響は観察されなかった。そこで方針を変え、HrasG12V誘導発現や亜鉛欠乏による細胞死応答が生じないマウス胎児線維芽細胞株3T3細胞由来の細胞（3T3RasVal細胞）で、同様の解析を試みた。その結果、3T3RasVal細胞では、HrasG12V発現ではIRE1活性化依存的なXbp1の非定型スプライシングが誘導されないことがわかった。以上から、HrasG12VによるMEK/ERK依存的IRE1活性化には、Rat-1にはあるが3T3にはない機構が関与すると考えられた。また、Rat-1RasVal細胞を用いた解析の過程で、培地への亜鉛添加とHrasG12V発現とに依存して変化する新たなシグナル系を見出した。