部位特異的変異法によるNO合成酵素の電子移動機構と酸素分子活性化機構の解明

生体内において極めて重要な働きをする伝達物質、一酸化窒素NO、をアルギニンから合成する神経型NO合成酵素(以下NOSと略す)の構造一機能相関、特に電子伝達及び酸素分子活性化の機構について研究した。1. NOSはL-Argから2段階の一酸素添加反応を経てNOを合成する。NOSはP450型ヘムを活性部位に保持している。NOSにおいても、P450と同様にAsp/Glu及びThrがO-O解裂に関与しているのではないかと考えて、神経型NOSで良く保存されたAsp314,Thr315を変異させて、それら変異体の反応活性を調べた。これら変異体の反応活性はP450の対応する変異体の挙動と非常に良く似たものであった。2. 神経型NOSの自動酸化速度を始めて測定した。自動酸化速度は3相より成っていた。この速度は、誘導型NOSの酸化酵素ドメインの自動酸化速度にくらべて2桁速かった。基質のL-Argやそれに類似した阻害剤の添加によって、特に、第1相及び第2相の酸化速度は著しく低下した。プテリンは第2相の割合を著しく増加させた。いっぽう、プテリンの存在下、基質や阻害剤によって酸化速度は変化しなかったが、反応中間体であるOH-L-Argによって第1相の酸化速度は著しく低下した。これらのことより、(1)L-Argは酸素結合型NOSを安定化する。(2)プテリンは酸素結合型NOSの自動酸化速度に影響を与えるが、その効果は、基質、阻害剤、中間体とは異なる。(3)中間体は自動酸化速度に基質とは異なる効果を与える。が示唆された。

生体内において極めて重要な働きをする伝達物質、一酸化窒素NO、をアルギニンから合成する神経型NO合成酵素(以下NOSと略す)の構造一機能相関、特に電子伝達及び酸素分子活性化の機構について研究した。1. NOSはL-Argから2段階の一酸素添加反応を経てNOを合成する。NOSはP450型ヘムを活性部位に保持している。NOSにおいても、P450と同様にAsp/Glu及びThrがO-O解裂に関与しているのではないかと考えて、神経型NOSで良く保存されたAsp314,Thr315を変異させて、それら変異体の反応活性を調べた。これら変異体の反応活性はP450の対応する変異体の挙動と非常に良く似たものであった。2. 神経型NOSの自動酸化速度を始めて測定した。自動酸化速度は3相より成っていた。この速度は、誘導型NOSの酸化酵素ドメインの自動酸化速度にくらべて2桁速かった。基質のL-Argやそれに類似した阻害剤の添加によって、特に、第1相及び第2相の酸化速度は著しく低下した。プテリンは第2相の割合を著しく増加させた。いっぽう、プテリンの存在下、基質や阻害剤によって酸化速度は変化しなかったが、反応中間体であるOH-L-Argによって第1相の酸化速度は著しく低下した。これらのことより、(1)L-Argは酸素結合型NOSを安定化する。(2)プテリンは酸素結合型NOSの自動酸化速度に影響を与えるが、その効果は、基質、阻害剤、中間体とは異なる。(3)中間体は自動酸化速度に基質とは異なる効果を与える。が示唆された。