金属錯体抗生物質・センサー蛋白質による遺伝子発現制御機構

金属复合物抗生素和传感器蛋白的基因表达控制机制

• 批准号: 10129223
• 负责人: 杉山 政則
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Hiroshima University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1998 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10129223/
• 关键词: X線結晶構造解析; 金属錯体; 抗生物質; ブレオマイシン; ブレオマイシン結合蛋白質; 大腸菌; 蛋白質の結晶化

平成10年度は、Tn5由来のブレオマイシン(Bm)耐性遺伝子産物(BLMTと命名)の性質を調査するため、先ず、大腸菌のホスト・ベクター系を用いてBLMTの大量発現系を確立した。さらに、BLMTを精製し、本蛋白質がBmを特異的に認識し、Bmに結合する蛋白質であることを明らかにした。一方、Tn5由来のBm耐性遺伝子bleを大腸菌に導入すると、非導入に比べ、宿主大腸菌が長く生存できる(survival advantageと命名)ことを見い出した。さらに、site-directed mutagenesis法を用いて、BLMTの7番目のProlineをLeucineに置換することで、Bm結合能を失わせた変異BLMTを作成した。この変異型BLMTを産生する大腸菌の生存能を調べた結果、野生型BLMTを産生する大腸菌と同等のsurvival advantageが付与された。この結果はBLMTのBm結合能とsurvival advantageを付与する能力は非依存的であることを示す。次に、BLMTのX線結晶構造解析をするため、その結晶化を行い、予備的なX線結晶構造解析を試みた。その結果、本結晶は斜方晶系に属し、空間群C222_1、格子定数はa=81.56,b=85.25,c=78.91Åであった。回折強度データの収集をPhoton FactoryのBL18Bにて波長1.0Åで行った結果、1つの結晶から2.0Å分解能での完全なデータセットを収集できた。得られたデータセットのR_<merge>は0.052、完全性は90.6%であった。BLMTの構造解析は分子置換法にて行った。その初期モデルをX-PLORを用い精密化を行った結果、2.0Å分解能での最終モデルは、水分子90個を含み、R=19.3%,R_<free>=25.8%となった。得られたBLMTの三次元構造は、主鎖のホールディングにおいて、BLMAとほぼ同じであった。

In 2010, we investigated the properties of BLMT (named BLMT) derived from Tn5, and established a large number of BLMT development systems for the use of BLMT. BLMT is refined, and the protein is recognized as Bm specific. Tn5 is derived from a Bm-resistant gene that is introduced into E. coli, non-introduced into E. coli, and long-term survival of host E. coli (survival advantage naming). In addition, the site-directed mutagenesis method is used to create the BLMT 7-point Proline. The survival advantage of E. coli produced by heterotypic BLMT is regulated as a result, and that of E. coli produced by wild-type BLMT is equivalent. The result is that BLMT has a survival advantage. In addition, X-ray crystal structure analysis of BLMT was carried out in preparation for X-ray crystal structure analysis. The crystal belongs to orthorhombic system, space group C222_1, lattice number a= 81.56, b = 85.25, c =78.91. Photon Factory's BL 18B wavelength is 1.0 nm, and its crystal decomposition energy is 2.0 nm. R_R <merge>= 0.052, completeness = 90.6% BLMT structural analysis is carried out by molecular substitution method. X-PLOR is used to refine the initial phase of the reaction. The final phase of the reaction is 2.0 ° C. The final phase contains 90 water molecules. R= 19.3%, R_<free>=25.8%. BLMT is a three-dimensional structure.

项目成果

Ishikawa, Y.: "Oxidative and random cleavage of DNA by the novel iron (II) complex capable of yielding an iron (III) hydroperoxide intermediate" Chem.Lett.39-40 (1998)

Ishikawa, Y.：“能够产生铁 (III) 氢过氧化物中间体的新型铁 (II) 复合物对 DNA 的氧化和随机切割” Chem.Lett.39-40 (1998)

Kumagai. T.: "Characterization of the bleomycin resistance determinant encoded on the transposon Tn5 ."FEBS lett.. 442. 34-38 (1999)

熊谷。

Ikeda,K.: "Construction of a new cloning vector utilizing a cryptic plasmid and the highly expressed melanin-synthesizing gene operon from Streptomyces castaneoglobisporus" FEMS Microbiol.Lett.168. 195-199 (1998)

Ikeda,K.：“利用隐秘质粒和来自栗球孢链霉菌的高表达黑色素合成基因操纵子构建新的克隆载体”FEMS Microbiol.Lett.168。

Nishimura, M.: "Purification and characterization of a puromycin-hydrolyzing enzyme from blasticidin S-producing Streptomyces morookaensis" J.Biochem.123. 247-252 (1998)

Nishimura, M.：“产杀稻瘟素 S 莫鲁卡链霉菌中嘌呤霉素水解酶的纯化和表征”J.Biochem.123。

Kumagai,T.: "Crystarization and preliminary X-ray diffraction studies of bleomycin-binding pretein encoded on the transposon Tn5" Acta Cryst.Sec.D. (in press). (1999)

Kumagai,T.：“转座子 Tn5 上编码的博莱霉素结合蛋白的结晶和初步 X 射线衍射研究”Acta Cryst.Sec.D。