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酵母再構成系を用いたγセクレターゼの機能解析

使用酵母重组系统对γ-分泌酶进行功能分析

基本信息

批准号：
13J09015
负责人：
米村洋而
金额：
$ 1.32万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2013
资助国家：
日本
起止时间：
2013-04-01 至 2015-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13J09015/
关键词：
γセクレターゼプレセニリン Aph1 酵母アルツハイマー病 Aah1

项目摘要

γセクレターゼはプレセニリン（PS1またはPS2）、ニカストリン（NCT）、Aph1（Aph1-aL、-aS、または-b）、Pen2の4つから構成される複合体である。アルツハイマー病の原因とされるアミロイドβ（Aβ）はγセクレターゼによって前駆体タンパク質（APP）から産生される。またγセクレターゼはNotch受容体を切断することによって、細胞の分化・発生など細胞の運命決定に重要な役割を果たすNotchシグナリングも制御している。従って、Aβ産生抑制を目的としたγセクレターゼ阻害剤はNotchシグナリング阻害による副作用をも引き起こすことが知られている。私は、PSとAph1の組み合わせの違いによって生じる6つの異なるγセクレターゼを酵母に発現させ、レポーターアッセイによってAPPとNotchに対する切断活性を調べた。その結果、PS2/Aph1bのγセクレターゼがAPP切断を行う一方、Notch切断はほとんど行っていないことが示唆された。次に、HEK293細胞を用いたPSとAph1のダブルノックダウンによって、異なるγセクレターゼの機能の違いを明らかにすることを試みた。しかし、PS1のノックダウンが不十分であったため、それぞれのγセクレターゼの違いを明確に示すことはできなかった。そこで、海外の研究者らによって樹立されたshRNA安定発現HEK293細胞株を用いた解析を行うこととした。これらの細胞株はPS、Aph1がそれぞれほぼ1種類のみ発現しており、個別のγセクレターゼを評価するのに最適であると考えられた。現在、これらの細胞株にγセクレターゼの基質となるNotch受容体をトランスフェクションし、異なるγセクレターゼによるNotch切断に違いがみられるか検討している。さらに、産生されるAβ分子種の違いもELISAキットで調べる予定である。

γ (PS1 PS2),(NCT), 1 (Aph1-aL, -aS, -b), 2 The cause of the disease is β (Aβ), which is the precursor of APP. Notch receptor cleavage is an important factor in cell differentiation and development. However, it is now known that the purpose of inhibiting Aβ production is to prevent the side effects of Notch signaling. The activity of the enzyme was modulated by the activity of the enzyme, and the activity of the enzyme. PS2/Aph1b γSecond, HEK293 cells use PS and Aph1 to test their functionality. For PS1, it's not easy to get rid of it. It's not easy to get rid of it. The HEK293 cell line was established by overseas researchers. The cell lines PS, Aph1 and Aph1 were evaluated for their optimal development. Now, these cell lines are not suitable for cell culture. They are not suitable for cell culture. Aβ molecule species is produced in the presence of a pre-determined enzyme.