翻訳後修飾を基盤とする新規の時計振動体の探索

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転写・翻訳を介した概日時計の分子発振が約24時間という長い周期を安定に維持するためには、時計タンパク質のリン酸化などによる翻訳後制御が重要な役割を担うことが知られている。本研究においては、1) 細胞への物理化学ストレスや 2) セカンド・メッセンジャーとしての活性酸素種シグナルがキナーゼシグナルに変換される過程を経て、概日時計を制御する機構の解明を目指す。1) 昨年度までに、培養細胞への高浸透圧刺激が時計遺伝子Dec1, Dec2およびE4bp4を急速に転写誘導して細胞時計をリセットすることを見出した。本年度はこのリセットシグナリング経路の全貌に迫るために、時計機構とストレス応答の間を共役する因子としてストレス応答性MAPKKKであるASK (Apoptosis Signal-regulating Kinase) ファミリーに着目した。培養細胞におけるASKシグナルを活性化させると細胞の転写リズムの振幅が顕著に減弱した。また、ASKシグナル活性を阻害した場合、時計の発振速度にはほぼ影響がみられないが、ストレス刺激により細胞時計の位相シフト幅が減弱した。2) レドックス環境に応答する新規の蛍光プローブセンサーを培養細胞に発現させると、その蛍光強度 (FRET) を測定することにより細胞内レドックス環境を可視化できる。昨年度に確立したこの実験系により、カタラーゼ阻害剤の投与が細胞内環境を酸化的に傾けることを確認した。続いて、細胞時計の同調後、様々な時刻にFRET ratioを解析することによりレドックス環境が日周変動する傾向を見出した。さらに、このプローブを培養細胞だけでなく生体組織に対して導入するため、アデノ随伴ウイルス発現ベクターを用いた遺伝子導入法を採用し、哺乳類の時計中枢であるマウス視交叉上核の組織切片に対してプローブセンサーを発現させることに成功した。