細胞外環境での小さな操作分子イメージングツールの開発

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最終年度として、これまで作成したプローブ全体について、評価をとりまとめ、応用への可能性について検討した。本課題が最重要課題とした、細胞外環境イメージング、さらに分子間相互作用解析が、この課題内で作成した一連の蛍光プローブを用いてはじめて可能となったことが、細胞外マトリクスタンパクにおいて証明できた。分子間相互作用では光変換型蛍光タンパク改変体を用いて、その変換特性を利用したFLIM-FRETが有効である事を示した。さらにまた、小胞体内腔での分子ダイナミクスを厳密に測定する場合に、特にこの改良した光変換型蛍光プローブが有用性を持つことも示した。これらを用いる事により、小胞体構造の変化の見かけの分子拡散に与える影響について知る事ができた。蛍光タグの大きさの問題に着目したプロジェクトにおいては、phototropin由来フラビン結合タンパクから改変された分子においてもっともよくその有用性が示され、これまでライブイメージングで再現されてなかった分泌タンパクの変異の異常性が、この改変体において唯一、再現されることを示した。さらに、このタグの最大の課題であった輝度について、飽和変異を重ねることにより、最終的に、既報のプローブの2倍程度に改善することができた。これは分子イメージングとして実用に足りる明るさである。最終的に、本研究目的において開発した蛍光タグは10種類を超える。これらは、細胞がどのようにして酸化的環境における生存戦略を進めてきたかを理解する新たなツールとなると期待される。