糖鎖プロセシング酵素と相同性を有する酵素の立体構造解析に基づく新規オリゴ糖の創出

基于与糖链加工酶同源的酶的 3D 结构分析创建新的寡糖

• 批准号: 13J07279
• 负责人: 宮崎 剛亜
• 金额: $ 1.32万
• 依托单位: Tokyo University of Agriculture and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2013
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2013-04-01 至 2015-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13J07279/
• 关键词: N結合型糖鎖; 糖質加水分解酵素; オリゴ糖; X線結晶構造解析; グライコシンターゼ; フッ化糖; グルコシダーゼ; ガラクトシダーゼ

本研究は、真核生物の有するN結合型糖鎖プロセシング酵素およびそれと相同性を有する細菌由来機能未知酵素を対象とし、X線結晶構造解析に基づく反応機構の解明および基質特異性に関わるアミノ酸残基の特定、さらにグライコシンターゼ化による有用なオリゴ糖および糖鎖合成酵素を作出することを目的とした。前年度より引き続き、プロセシングα-グルコシダーゼⅠが属する糖質加水分解酵素ファミリー63（GH63）、そしてプロセシングα-グルコシダーゼⅡが属するファミリー31（GH31）の酵素について研究を行い、主に以下の成果を得た。1. 大腸菌由来GH63酵素YgjKは前年度までに二糖2-O-α-グルコシルガラクトースを生成する2種類のグライコシンターゼ変異体（D324NおよびE727A）を得ている。前年度に行った二糖との複合体構造解析に基づき新たな変異体を構築し、糖の合成能を比較した。その結果、GH63酵素の活性部位近傍に保存されているチロシン残基をフェニルアラニンに置換した変異体のオリゴ糖合成能が最も高いことがわかった。2. 近年グルコシル-/マンノシル-グリセリン酸加水分解酵素と同定された好熱菌由来GH63酵素（Tt8MGH）のX線結晶構造解析を行った。Tt8MGHのアポ構造、生成物であるグルコースまたはグリセリン酸との複合体構造を1.67-2.10 Å分解能で決定し、Tt8MGHに特徴的な3つのループが基質認識に関与していることがわかった。3. 細菌由来GH31機能未知酵素（PsGal31A）の大腸菌発現系の構築、組換え酵素の性質解析を行ったところ、GH31として初めてα-ガラクトシダーゼ活性を示す酵素であることがわかった。また、X線結晶構造解析によりPsGal31Aの立体構造を明らかにし、本酵素のユニークな基質特異性に関する知見を得た。以上の成果により、GH31およびGH63に属するユニークな基質特異性を有する加水分解酵素を新規なオリゴ糖合成酵素に変換するための基盤を確立した。

This study aims to identify and characterize the N-linked glycogen synthase and glycogen synthase in eukaryotes with unknown functions, X-ray crystallographic analysis of the enzyme structure, identification of the enzyme structure and substrate specificity. In the past year, the following results were obtained from the research on the enzyme of α-glucagon hydrolysis enzyme GH63 (GH63) and α-glucagon hydrolysis enzyme GH31 (GH31). 1. Escherichia coli derived from GH63 enzyme YgjK from the previous year to disaccharide 2-O-α-glucuronidase production, two types of glucuronidase variant (D324N and E727A) was obtained. In the past year, the structure of disaccharides and carbohydrates was analyzed, and the structure of new disaccharides and carbohydrates were compared. As a result, GH63 enzyme activity site near the preservation of the most important residues, such as sugar, sugar 2. In recent years, X-ray crystal structure analysis of GH63 enzyme (Tt8 MGH) has been carried out. Tt8 MGH's complex structure and products are determined by decomposition energy of 1.67-2.10 μ m, and the characteristics of Tt8 MGH are related to matrix recognition. 3. Construction and characterization of Escherichia coli production system of unknown enzyme (PsGal31A) derived from bacteria GH31 X-ray crystallographic analysis of PsGal 31A revealed the three-dimensional structure of PsGal 31A and the substrate specificity of the enzyme. The above results establish the basis for the conversion of the substrate-specific hydrolytic enzymes GH31 and GH63 into new sugar synthase enzymes.

项目成果

α-ガラクトシダーゼ活性を示す新奇な細菌由来GH31グリコシダーゼのX線結晶構造解析

具有 α-半乳糖苷酶活性的新型细菌 GH31 糖苷酶的 X 射线晶体结构分析

• 发表时间: 2014
• 作者: 宮崎 剛亜;市川 めぐみ;西河 淳;殿塚 隆史
• 通讯作者: 殿塚 隆史

The side chain of a glycosylated asparagine residue is important for the stability of isopullulanase.

• DOI: 10.1093/jb/mvu065
• 发表时间: 2015-04
• 期刊: Journal of biochemistry
• 影响因子: 2.7
• 作者: T. Miyazaki;H. Yashiro;A. Nishikawa;T. Tonozuka

Pedobacter saltans 由来GH31 α-ガラクトシダーゼとリガンドとの複合体構造解析

Pedobacter saltans GH31 α-半乳糖苷酶与配体复合物的结构分析

• 发表时间: 2015
• 作者: 宮崎 剛亜;石嵜 雄一;西河 淳;殿塚 隆史
• 通讯作者: 殿塚 隆史

Crystal structure and substrate-binding mode of GH63 mannosylglycerate hydrolase from Thermus thermophilus HB8.

来自嗜热栖热菌 HB8 的 GH63 甘露糖基甘油酸水解酶的晶体结构和底物结合模式。

• DOI: 10.1016/j.jsb.2015.02.006
• 发表时间: 2015
• 期刊: Journal of Structural Biology
• 影响因子: 3
• 作者: Takatsugu Miyazaki;Megumi Ichikawa;Hitoshi Iino;Atsushi Nishikawa and Takashi Tonozuka
• 通讯作者: Atsushi Nishikawa and Takashi Tonozuka

Conformational changes and substrate recognition of an uncharacterized glycosidase YgjK belonging to GH63 from Escherichia coil.

属于大肠杆菌 GH63 的未表征糖苷酶 YgjK 的构象变化和底物识别。

• 发表时间: 2013
• 作者: Takatsugu Miyazaki;Megumi Ichikawa;Haruhide Mori;Motomitsu Kitaoka;Yoshikazu Kitano;Atsushi Nishikawa and Tonozuka Tonozuka.
• 通讯作者: Atsushi Nishikawa and Tonozuka Tonozuka.