Single-molecule visualization and mechanisms of DNA recombination and intersecting DNA transactions

项目说明： -- 本次提案的广泛而客观的内容，是为了更好地理解同源重组的运行机制，并进一步完善其运行机制。 在细菌和真核生物中，染色体的关系都与染色体的维护有关。我们的新方法需要重新构建。 越来越多的更复杂的反应，这些反应将概括总结新的同源基因重组过程的主要步骤。 使用从大肠杆菌中提取的蛋白质和从酿酒酵母中提取的蛋白质来使用这些复杂的蛋白质。 生物化学和生物物理的分析方法。尤其是，我们将不再使用单分子的可视化技术。 图像：这些复杂的生物转化过程中的关键步骤和中间体。我们已经开发了一种新的技术。 实验研究策略是为了在单分子水平上进一步研究蛋白质-DNA的相互作用。我们设计了几个实验。 在这些方法中，我们可以很容易地操纵一个单独的DNA分子，并将其暴露在不同种类的DNA中。 不同的蛋白质、不同的酶、酶和缓冲液。通过使用荧光检测，我们可以对DNA上的单个蛋白质进行成像。 或检测它们对单个DNA分子的有效作用，通常是实时检测的。我们建议继续使用这些药物。 需要研究尚未解决的重组DNA修复技术方面的问题，并改进其与其他重要技术的接口。 生物信息学处理染色质重塑过程和DNA复制过程。我们将寻求机会继续解决这个悬而未决的问题。 关于RECA/RAD51的核蛋白和细丝的动态生物学行为以及它们的最新调控机制的问题。 蛋白质是调节和调节的物质；;是一种新的机制，通过它，RecA和RAD51可以找到DNA的同源性；;。 基因重组越来越依赖于更复杂的重组过程，而不是使用纯化的蛋白质；;是最重要的机制。 以及;对解旋酶的作用和对其主要伴侣蛋白质的作用；DNA解旋酶的作用和对其作用机制的理解。 这些交易与重组相互交织，即染色质重塑和DNA复制。

Project Description     The broad objective of this proposal is to understand the mechanism of homologous recombination and its  relationship to chromosome maintenance in both Bacteria and Eukarya. Our approach is to reconstitute  increasingly more complex reactions that recapitulate the steps of the homologous recombination process,  using purified proteins from Escherichia coli and from Saccharomyces cerevisiae, and to use sophisticated  biochemical and biophysical methods of analysis. In particular, we will use single-­molecule visualization to  image key steps and intermediates of these complex biological processes. We have developed new  experimental strategies for studying protein-­DNA interactions at the single-­molecule level. We devised several  approaches wherein we could easily manipulate an individual DNA molecule and expose it to a variety of  different proteins, enzymes, and buffers. Using fluorescent detection, we can image individual proteins on DNA  or detect their action on individual DNA molecules, typically in real-­time. We propose to continue to use these  approaches to study unresolved aspects of recombinational DNA repair and its interface with the important  biological processes of chromatin remodeling and DNA replication. We seek to continue to address unresolved  questions regarding the dynamic behavior of RecA/Rad51 nucleoprotein filaments and their regulation by  protein mediators and modulators;; the mechanism by which RecA and Rad51 find DNA sequence homology;;  the reconstitution increasingly more complex recombination processes using purified proteins;; the mechanism  and function of DNA helicases and their partner proteins;; and understanding the mechanism of DNA  transactions that intersect with recombination, namely, chromatin remodeling and DNA replication.