Single-molecule visualization and mechanisms of DNA recombination and intersecting DNA transactions

单分子可视化以及 DNA 重组和交叉 DNA 事务的机制

• 批准号: 10374054
• 负责人: Stephen Charles Kowalczykowski
• 金额: $ 80.25万
• 依托单位: UNIVERSITY OF CALIFORNIA AT DAVIS
• 依托单位国家: 美国
• 财政年份: 2019
• 资助国家: 美国
• 起止时间: 2019-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://reporter.nih.gov/project-details/10374054
• 关键词: Address; Bacteria; Behavior; Biochemical; Biological Process; Buffers; Chromosome Structures; Chromosomes; Complex; DNA; DNA Repair; DNA Sequence; DNA biosynthesis; DNA-Protein Interaction; Detection; Enzymes; Escherichia coli Proteins; Filament; Genetic Recombination; Image; Individual; Maintenance; Mediator of activation protein; Nucleoproteins; Process; Proteins; Reaction; Regulation; Saccharomyces cerevisiae; Sequence Homology; Time; Transact; Visualization; biophysical techniques; chromatin remodeling; helicase; homologous recombination; reconstitution; single molecule

Project Description     The broad objective of this proposal is to understand the mechanism of homologous recombination and its  relationship to chromosome maintenance in both Bacteria and Eukarya. Our approach is to reconstitute  increasingly more complex reactions that recapitulate the steps of the homologous recombination process,  using purified proteins from Escherichia coli and from Saccharomyces cerevisiae, and to use sophisticated  biochemical and biophysical methods of analysis. In particular, we will use single-­molecule visualization to  image key steps and intermediates of these complex biological processes. We have developed new  experimental strategies for studying protein-­DNA interactions at the single-­molecule level. We devised several  approaches wherein we could easily manipulate an individual DNA molecule and expose it to a variety of  different proteins, enzymes, and buffers. Using fluorescent detection, we can image individual proteins on DNA  or detect their action on individual DNA molecules, typically in real-­time. We propose to continue to use these  approaches to study unresolved aspects of recombinational DNA repair and its interface with the important  biological processes of chromatin remodeling and DNA replication. We seek to continue to address unresolved  questions regarding the dynamic behavior of RecA/Rad51 nucleoprotein filaments and their regulation by  protein mediators and modulators;; the mechanism by which RecA and Rad51 find DNA sequence homology;;  the reconstitution increasingly more complex recombination processes using purified proteins;; the mechanism  and function of DNA helicases and their partner proteins;; and understanding the mechanism of DNA  transactions that intersect with recombination, namely, chromatin remodeling and DNA replication.

项目描述     该提案的广泛目标是了解同源重组的机制及其  与细菌和真核生物染色体维持的关系。 我们的方法是重构  越来越复杂的反应概括了同源重组过程的步骤，  使用来自大肠杆菌和酿酒酵母的纯化蛋白质，并使用复杂的  生化和生物物理分析方法。 特别是，我们将使用单分子可视化来  对这些复杂的生物过程的关键步骤和中间过程进行成像。 我们开发了新的  在单分子水平上研究蛋白质-DNA 相互作用的实验策略。 我们设计了几个  我们可以轻松地操纵单个 DNA 分子并将其暴露于各种不同的方法中  不同的蛋白质、酶和缓冲液。 使用荧光检测，我们可以对 DNA 上的单个蛋白质进行成像  或者检测它们对单个 DNA 分子的作用，通常是实时的。 我们建议继续使用这些  研究重组 DNA 修复的未解决方面及其与重要物质的界面的方法  染色质重塑和 DNA 复制的生物过程。 我们寻求继续解决未解决的问题  关于 RecA/Rad51 核蛋白丝的动态行为及其调节的问题  蛋白质介体和调节剂；RecA 和 Rad51 发现 DNA 序列同源性的机制；；  使用纯化蛋白质的重组过程越来越复杂；；机制  DNA 解旋酶及其伴侣蛋白的功能；；以及了解 DNA 的机制  与重组相交叉的事务，即染色质重塑和 DNA 复制。