Single-molecule visualization and mechanisms of DNA recombination and intersecting DNA transactions

点击翻译按钮获取中文摘要

Project Description     The broad objective of this proposal is to understand the mechanism of homologous recombination and its  relationship to chromosome maintenance in both Bacteria and Eukarya. Our approach is to reconstitute  increasingly more complex reactions that recapitulate the steps of the homologous recombination process,  using purified proteins from Escherichia coli and from Saccharomyces cerevisiae, and to use sophisticated  biochemical and biophysical methods of analysis. In particular, we will use single-­molecule visualization to  image key steps and intermediates of these complex biological processes. We have developed new  experimental strategies for studying protein-­DNA interactions at the single-­molecule level. We devised several  approaches wherein we could easily manipulate an individual DNA molecule and expose it to a variety of  different proteins, enzymes, and buffers. Using fluorescent detection, we can image individual proteins on DNA  or detect their action on individual DNA molecules, typically in real-­time. We propose to continue to use these  approaches to study unresolved aspects of recombinational DNA repair and its interface with the important  biological processes of chromatin remodeling and DNA replication. We seek to continue to address unresolved  questions regarding the dynamic behavior of RecA/Rad51 nucleoprotein filaments and their regulation by  protein mediators and modulators;; the mechanism by which RecA and Rad51 find DNA sequence homology;;  the reconstitution increasingly more complex recombination processes using purified proteins;; the mechanism  and function of DNA helicases and their partner proteins;; and understanding the mechanism of DNA  transactions that intersect with recombination, namely, chromatin remodeling and DNA replication.