KINETICS OF CHROMOPHORE PROTONATION IN EGFP DETERMINED BY FCS

FCS 测定 EGFP 中发色团质子化的动力学

• 批准号: 6121942
• 负责人: SUDIPTA MAITI
• 金额: $ 0.03万
• 依托单位: CORNELL UNIVERSITY
• 依托单位国家: 美国
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 美国
• 起止时间: 1998-09-30 至 1999-08-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://reporter.nih.gov/project-details/6121942
• 关键词: bioengineering /biomedical engineering; biomedical resource; education; technology /technique

Poster at the Biophysical Society Meeting, Feb 22-26 in Kansas City MO Fluorescence correlation spectroscopy (Magde et al. 1972, Phys. Rev. Lett. 29:705) is uniquely suited for determination of the rate constants of molecular dynamics and chemical kinetics of spontaneous processes. Statistical physics dictates that the fluorescence obtained from the small probe volume employed in FCS fluctuates about a mean value, due to individual molecules diffusing in and out of the volume and/or due to inter-conversion of such molecules to and from a non-fluorescent form. The autocorrelation function therefore contains information about chemical reaction kinetics, coefficients of diffusion and the equilibrium chemical concentrations. GFP fluorescence is highly dependent on the protonation state and external conditions (Ward et al. 1982, Photochem. Photobiol. 35:803-808). Using one-photon excitation (488nm) with confocal fluorescence detection and alternatively two-photon excitation (910nm), we have identified a spontaneous modulation of the fluorescence with a charact eristic time constant around 200 (s. The amplitude of the modulation is pH dependent; with decreasing pH an increasing fraction of molecules is found in a nonfluorescent state (in agreement with bulk measurements). The kinetics are temperature dependent yielding an activation energy of about 10 kcal/mol and are slowed down in D2O by a factor of about 1.5. From these results we conclude that the observed kinetics represent thermal interconversion between two states of the fluorophore (Brejc et al. 1997, Proc. Acad. Natl. Sci. USA 94:2306-2311): protonated (?abs~400nm, not well-excited by 488nm) and unprotonated (?abs~490nm). This process is distinguished from that recently reported (Dickson et al., Nature 388:355-358) at much slower time-scales (~1s).

2 月 22 日至 26 日在堪萨斯州举行的生物物理学会会议上的海报 城市 MO 荧光相关光谱（Magde 等人，1972 年， 物理。 莱特牧师。 29:705）特别适合确定 分子动力学和化学动力学的速率常数 自发过程。 统计物理学表明 从 FCS 中使用的小探针体积获得的荧光 由于单个分子扩散，在平均值附近波动 进出体积和/或由于此类的相互转换 分子与非荧光形式之间的转换。 自相关 因此函数包含有关化学反应的信息 动力学、扩散系数和化学平衡 浓度。 GFP 荧光高度依赖于 质子化状态和外部条件（Ward 等人，1982， 光化学。 光生物。 35：803-808）。 使用单光子激发 (488nm) 共焦荧光检测，或者 双光子激发（910nm），我们已经识别出自发的 用特征时间常数调制荧光 大约 200 (s. 调节幅度取决于 pH 值； 降低 pH 值会增加分子分数 非荧光状态（与批量测量一致）。 这 动力学取决于温度，产生的活化能为 约 10 kcal/mol，在 D2O 中减慢约 1.5 倍。 从这些结果我们得出结论，观察到的动力学代表 荧光团两种状态之间的热相互转换（Brejc 等人。 1997，Proc。 阿卡德。 国家。 科学。美国 94:2306-2311)：质子化 （?abs~400nm，488nm 未充分激发）和非质子化（?abs~490nm）。 这个过程与最近报道的过程不同（Dickson 等 al., Nature 388:355-358），时间尺度要慢得多（~1s）。