Functional and structural analyses of plant ATG8-RabGAP interactions

植物 ATG8-RabGAP 相互作用的功能和结构分析

基本信息

  • 批准号:
    1655056
  • 负责人:
  • 金额:
    --
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    英国
  • 项目类别:
    Studentship
  • 财政年份:
    2015
  • 资助国家:
    英国
  • 起止时间:
    2015 至 无数据
  • 项目状态:
    已结题

项目摘要

Due to the lack of circulatory system and mobile immune cells, plant immunity hinges on cell autonomous immunity. A key component of this immunity is the catabolic process of autophagy, once thought to be a non-specific degradation pathway. The discovery of pathogen-specific plant cargo receptors suggested a role for autophagy in immunity. Like many plant pathogens, Phytophthora infestans, the oomycete responsible for late blight disease in potato, relies on host modulation and suppression of immunity through proteinaceous effectors to infect its host. A recent study has shown that the P. infestans secreted effector PexRD54 outcompetes the host cargo receptor Joka2 for binding of the core autophagy protein ATG8CL through their common ATG8 interacting motif (AIM). Both the effector and cargo receptor trigger autophagosome formation in an AIM dependent manner. With such an essential pathway being activated by binding alone, it was suggested that there could exist a negative regulator. Mass spectrometry analysis of ATG8CL revealed a strong interaction with a RabGTPase activating protein, Rab3GAP. Bioinformatic analysis has shown that Rab3GAP carries a putative AIM, pointing towards a regulatory role in the ATG8CL autophagy pathway. Previous work showed that not only does Rab3GAP interact with ATG8CL in vivo but also reduces ATG8CL autophagosomes in an AIM dependent manner. Furthermore, preliminary data shows that Rab3GAP increases susceptibility to P. infestans.The primary objective of this study is to analyse Rab3GAP's role in the ATG8CL autophagy at the cellular, molecular and structural level. Furthermore, I aim to elucidate Rab3GAP's role in immunity against P. Infestans and to a wider extent, the role of the ATG8CL autophagy. I intend to use Nicotiana Benthamiana as a model system for infections, expression of proteins and cell biology. I also intend to make extensive use of the Agrobacterium transformation system for transient expression assays. This will pave the way for the creation of CRISPR/Cas9 transgenic lines. To achieve this, I will focus on three aims for this project:1. Elucidating Rab3GAP's role in the ATG8CL pathway.In order to investigate Rab3GAP's role in autophagy, I intend to use a multi-faceted approach of cellular and molecular biology. First, I aim to confirm Rab3GAP's interaction with ATG8CL's AIM through in vitro interaction assays. Furthermore, I will employ Co-IP followed by mass spectrometry analysis to determine the interacting partners of Rab3GAP that are associated to the ATG8CL pathway. I will investigate the role of candiate Rab3GAP interactors in autophagy via monitoring autophagic activity upon silencing or overexpression of the Rab3GAP interactors.2. Dissecting Rab3GAP's role in immunity against P. Infestans.We aim to elucidate the mechanisms behind the increased suscepbility to P. Infestans caused by Rab3GAP. The first step would be to determine if the effect on immunity is due to the ATG8CL pathway. Secondly, we intend to look into the other domains of Rab3GAP. The GAP active site is of particular interest and indentifying the associated Rab(s) would give us insight into Rab3GAP's role in the network of membrane traffic pathways.3. Structural and functional analyses of Rab3GAP and its partners in autophagyThe final facet of our approach is to structurally characterise Rab3GAP's interactions and gain insights into its suppresive role in autophagosome formation. Understanding Rab3GAP's binding dynamics with other members of the ATG8CL autophagic pathway could help us understand the network of interactions in the pathways. We intend to identify the Rab(s) associated with Rab3GAP by modifying the catalytic arginine in the GAP active site and GTP-locking any potential Rabs to stabilise the interaction. Linking structural observations with protein function would allow us to describe essential motifs in Rab3GAP and maybe even in other members of the Rab superfamily.
由于缺乏循环系统和移动的免疫细胞,植物免疫依赖于细胞自主免疫。这种免疫的一个关键组成部分是自噬的分解代谢过程,曾经被认为是一种非特异性降解途径。病原体特异性植物货物受体的发现表明自噬在免疫中的作用。与许多植物病原体一样,致病疫霉(Phytophthora infestans)(马铃薯中引起晚疫病的卵菌纲)依赖于宿主调节和通过蛋白质效应物抑制免疫来感染其宿主。最近的一项研究表明,致病疫霉分泌的效应子PexRD 54通过其共同的ATG 8相互作用基序(AIM)与宿主货物受体Joka 2竞争结合核心自噬蛋白ATG 8 CL。效应受体和货物受体均以AIM依赖性方式触发自噬体形成。由于这种重要途径仅通过结合激活,因此建议可能存在负调节剂。ATG 8 CL的质谱分析揭示了与RabGT β活化蛋白Rab 3GAP的强相互作用。生物信息学分析表明Rab 3GAP携带一个推定的AIM,指向在ATG 8 CL自噬途径中的调节作用。先前的工作表明Rab 3GAP不仅在体内与ATG 8 CL相互作用,而且还以AIM依赖性方式减少ATG 8 CL自噬体。本研究的主要目的是从细胞、分子和结构水平分析Rab 3GAP在ATG 8 CL自噬中的作用。此外,我的目标是阐明Rab 3GAP在免疫中对P. Infestans的作用,并在更广泛的程度上,ATG 8 CL自噬的作用。我打算使用烟草作为感染,蛋白质表达和细胞生物学的模型系统。我还打算广泛使用农杆菌转化系统进行瞬时表达试验。这将为创建CRISPR/Cas9转基因株系铺平道路。为了实现这一目标,我将集中在这个项目的三个目标:1。Rab 3GAP在ATG 8 CL通路中的作用为了研究Rab 3GAP在自噬中的作用,我打算使用多方面的细胞和分子生物学方法。首先,我的目标是通过体外相互作用测定来确认Rab 3GAP与ATG 8 CL的AIM的相互作用。此外,我将采用Co-IP,然后进行质谱分析,以确定与ATG 8 CL途径相关的Rab 3GAP的相互作用伙伴。我将通过监测Rab 3GAP相互作用因子沉默或过表达后的自噬活性来研究候选Rab 3GAP相互作用因子在自噬中的作用。本研究旨在探讨Rab 3GAP在抗寄生虫免疫中的作用,阐明Rab 3GAP增强寄生虫免疫力的机制。第一步是确定对免疫力的影响是否是由于ATG 8 CL途径。其次,我们打算研究Rab 3GAP的其他结构域。差距活性位点是特别感兴趣的,识别相关的Rab(s)将使我们深入了解Rab 3GAP在膜交通途径网络中的作用。Rab 3GAP及其伙伴在自噬中的结构和功能分析我们方法的最后一个方面是从结构上阐明Rab 3GAP的相互作用,并深入了解其在自噬体形成中的抑制作用。理解Rab 3GAP与ATG 8 CL自噬通路其他成员的结合动力学可以帮助我们理解通路中的相互作用网络。我们打算通过修饰差距活性位点中的催化精氨酸和GTP锁定任何潜在的Rab以稳定相互作用来鉴定与Rab 3GAP相关的Rab。将结构观察与蛋白质功能联系起来将使我们能够描述Rab 3GAP甚至Rab超家族其他成员的基本基序。

项目成果

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