FLT LIGAND PERIPHERAL BLOOD STEM CELL MOBILIZATION FOR STEM CELL GENE THERAPY

用于干细胞基因治疗的 FLT 配体外周血干细胞动员

基本信息

  • 批准号:
    6591324
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 11.11万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    美国
  • 项目类别:
  • 财政年份:
    2002
  • 资助国家:
    美国
  • 起止时间:
    2002-05-01 至 2003-04-30
  • 项目状态:
    已结题

项目摘要

Optimization of the harvesting and transduction of hematopoietic stem cells is critical to successful stem cell gene therapy We evaluated the utility of a novel protocol involving flt-3 and G-CSF mobilization of peripheral blood stem cells and retroviral transduction using hematopoietic growth factors to introduce a reporter gene, murine CD24, into hematopoietic stem cells in nonhuman primates Rhesus macaques were treated with flt-3 ligand (200 mg/kg) and G-CSF (20 mg/kg) for 7 days and autologous CD34+ peripheral blood stem cells harvested by leukapheresis CD34+ cells were transduced with an MFG-based retroviral vector encoding murine CD24 using 4 daily transductions with centrifugations in the presence of flt-3 ligand (100 ng/ml), SCF (100 ng/ml) and PIXY (100 ng/ml) in serum free medium Animals were sublethally irradiated (400 cGy) on the day of transplantation Engraftment was monitored sequentially in the bone marrow and blood using both multiparameter flo w cytometry and semi-quantitative DNA PCR Our data demonstrate successful and persistent engraftment in multiple hematopoietic lineages, including granulocytes, monocytes and B and T lymphocytes At 46 and 117 days post transplantation 75% and 6% of granulocytes, respectively, expressed mCD24 antigen at the cell surface Peak in vivo levels of genetically-modified peripheral blood lymphocytes (PBL) approached 60% as assessed both by flow cytometry and PCR 18 days post transplantation In addition, naive (CD45RA+ and CD62L+) CD4+ and CD3+8+ cells were the predominant phenotype of the T cells detected at this time Engraftment has subsequently plateaued but persisted at between 10 and 15% of PBLs for 133 days Acytotoxic T cell response against murine CD24 was detected in only one animal This degree of persistent long-lived, high level gene marking of multiple hematopoietic lineages, including naive T cells, has important implications for the field of stem cell gene therapy
造血细胞收获和转导的优化 干细胞对于成功的干细胞基因治疗至关重要 评估了涉及 flt-3 和 G-CSF 的新方案的实用性 动员外周血干细胞和逆转录病毒 使用造血生长因子进行转导以引入 报告基因,鼠CD24,进入非人类的造血干细胞 用 flt-3 配体(200 毫克/千克)处理灵长类恒河猴 和 G-CSF (20 mg/kg) 7 天以及自体 CD34+ 外周血 通过白细胞去除术收获的干细胞 CD34+ 细胞被转导 基于 MFG 的逆转录病毒载体编码鼠 CD24,每天使用 4 在 flt-3 配体存在下通过离心进行转导 (100 ng/ml)、SCF (100 ng/ml) 和 PIXY (100 ng/ml),溶于无血清培养基 在当天对动物进行亚致死照射(400 cGy) 移植 在骨中连续监测植入情况 使用多参数流式细胞术和 半定量 DNA PCR 我们的数据表明成功且 在多种造血谱系中持续植入,包括 46 和 117 天时的粒细胞、单核细胞以及 B 和 T 淋巴细胞 移植后粒细胞分别为 75% 和 6%, 在细胞表面表达 mCD24 抗原 体内峰值水平 转基因外周血淋巴细胞(PBL)接近60% 术后 18 天通过流式细胞术和 PCR 进行评估 移植 此外,初始(CD45RA+ 和 CD62L+) CD4+ 和 CD3+8+ 细胞是检测到的 T 细胞的主要表型 这次植入随后趋于稳定,但持续在 133 天无细胞毒性 T 细胞反应,PBL 介于 10% 至 15% 之间 仅在一只动物中检测到针对小鼠 CD24 的这种程度 多个持久的、长期的、高水平的基因标记 造血谱系,包括初始 T 细胞,具有重要的作用 对干细胞基因治疗领域的影响

项目成果

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