The dopamine transporter's lipid interactions: understanding transporter function

多巴胺转运蛋白的脂质相互作用：了解转运蛋白的功能

• 批准号: 9601228
• 负责人: AURELIO GALLI
• 金额: $ 18.79万
• 依托单位: UNIVERSITY OF ALABAMA AT BIRMINGHAM
• 依托单位国家: 美国
• 财政年份: 2017
• 资助国家: 美国
• 起止时间: 2017-12-01 至 2019-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://reporter.nih.gov/project-details/9601228
• 关键词: dopamine; transporter; lipid; interactions; understanding

DESCRIPTION (provided by applicant): The dopamine (DA) transporter (DAT) controls DA homeostasis and neurotransmission by the active reuptake of synaptically released DA. The DAT is the major molecular target responsible for the rewarding properties and the abuse potential of amphetamine (AMPH) and cocaine. AMPH acts as a DAT substrate, promoting the reversal of DA transport, thereby resulting in DA efflux via DAT. This efflux leads to increased extracellular DA levels, an event of importance for the psychomotor stimulant properties of AMPHs. The N-terminus of the DAT is a structural domain that is critical for AMPH to cause DA efflux. We have shown that DAT N-terminus phosphorylation at the five most distal Ser is required for AMPH-induced DA efflux, but does not regulate DA uptake. Furthermore, our preliminary studies suggest that the DAT N-terminus interacts electrostatically with phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate PIP2 (a key phospholipid enriched at the inner leaflet of the plasma membrane), and that this interaction impairs DA efflux, but not uptake. Our mechanistic hypothesis is that upon phosphorylation, the DAT N-terminus uncouples from PIP2 to disengage from the membrane. Both of these events are required to elicit the DA efflux produced by AMPH. We propose to test our hypothesis and its implications for the behavioral effects of AMPH in vivo, through the following specific aims: 1) To determine the nature of the interaction between DAT N-terminus and PIP2, and describe it in a structural context provided by computational modeling; 2) To determine the role of N-terminus phosphorylation in regulating how DAT and PIP2 interact, and its effect on DAT function; 3) To determine the role of DAT/PIP2 interactions in AMPH-induced behaviors in Drosophila melanogaster. In this animal model, we have established that locomotion is a DAT-dependent behavior and is stimulated by AMPH. Deletion of Drosophila DAT (dDAT) in DA neurons of flies inhibits AMPH-induced locomotion, an effect that is restored by the expression of the human DAT (hDAT) in these dDAT-deficient DA neurons. Using this strategy, we will translate in vivo our molecular findings from specific aims 1 and 2. This will allow us to understand how hDAT N-terminus phosphorylation and associations with PIP2 determine AMPH-induced behaviors. The long-term goals of this research are to understand how AMPH-induced DA efflux and its associated behaviors are dictated by the interactions of hDAT N-terminus with PIP2, and/or by phosphorylation of the N- terminus. By specifically impairing DA efflux, but not uptake, we will determine the contribution of DA efflux in AMPH behaviors. The intent is to uncover novel targets for the treatment of AMPH abuse. From a broad perspective of transporter biology, we will reveal how a DAT structural domain (the N-terminus) via its interactions with the plasma membrane dictates different aspects of transport function.

描述（由申请人提供）：多巴胺（DA）转运蛋白（DAT）通过主动重摄取突触释放的 DA 来控制 DA 稳态和神经传递。 DAT 是导致安非他明 (AMPH) 和可卡因的有益特性和滥用潜力的主要分子靶点。 AMPH 作为 DAT 底物，促进 DA 转运的逆转，从而导致 DA 通过 DAT 流出。这种外流导致细胞外 DA 水平增加，这对于 AMPH 的精神运动兴奋特性非常重要。 DAT 的 N 末端是一个对于 AMPH 引起 DA 流出至关重要的结构域。我们已经证明，AMPH 诱导的 DA 流出需要 DAT N 末端 5 个最远端 Ser 的磷酸化，但不调节 DA 摄取。此外，我们的初步研究表明，DAT N 末端与磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸 PIP2（质膜内叶富集的一种关键磷脂）发生静电相互作用，并且这种相互作用会损害 DA 流出，但不会损害摄取。 我们的机制假设是，磷酸化后，DAT N 末端与 PIP2 解偶联，从而脱离膜。这两个事件都需要引发 AMPH 产生的 DA 流出。我们建议通过以下具体目标来测试我们的假设及其对 AMPH 体内行为影响的影响：1）确定 DAT N 末端和 PIP2 之间相互作用的性质，并在计算模型提供的结构背景中描述它； 2) 确定N端磷酸化在调节DAT和PIP2相互作用中的作用及其对DAT功能的影响； 3) 确定 DAT/PIP2 相互作用在果蝇 AMPH 诱导行为中的作用。在该动物模型中，我们确定运动是 DAT 依赖性行为，并受到 AMPH 的刺激。果蝇 DA 神经元中果蝇 DAT (dDAT) 的缺失会抑制 AMPH 诱导的运动，这种效应可以通过这些 dDAT 缺陷的 DA 神经元中人类 DAT (hDAT) 的表达来恢复。使用这种策略，我们将在体内转化特定目标 1 和 2 的分子发现。这将使我们能够了解 hDAT N 末端磷酸化以及与 PIP2 的关联如何决定 AMPH 诱导的行为。 本研究的长期目标是了解 AMPH 诱导的 DA 外流及其相关行为是如何由 hDAT N 末端与 PIP2 的相互作用和/或 N 末端磷酸化决定的。通过专门损害 DA 流出但不损害摄取，我们将确定 DA 流出在 AMPH 行为中的贡献。目的是发现治疗 AMPH 滥用的新靶点。从转运蛋白生物学的广阔角度来看，我们将揭示 DAT 结构域（N 末端）如何通过其与质膜的相互作用决定转运功能的不同方面。