A nucleosome sliding assay platform to screen inhibitors of SWI/SNF chromatin remodeling complexes

项目总结： 在这项新的提案中，EpiCypher Inc.将开发出第一个商业化的、可用于在线监测的检测设备。 核小体重塑，是目前理性药物开发的一个主要焦点，也是HTS新工具匮乏的原因。 核小体是染色质的两个基本单位，染色质由约147个碱基组成，DNA被紧密包裹在一个八聚体的周围。 组蛋白包括蛋白质、染色质和重塑复合体，这些复合体可以利用组蛋白来破坏DNA-组蛋白的相互作用。 重新定位核小体，从而规范DNA的获取。一个异常的核小体组织可能会严重扰乱细胞。 基因表达、DNA修复和细胞分化与癌症和包括癌症在内的精神障碍密切相关。 精神分裂症是一种慢性炎症、精神和智力障碍。它是人类重塑和情结重建的重要作用。 肿瘤发生和癌症进展是表观遗传学药物研究快速发现的一个新的靶点。 正在引起我们所有商业合作伙伴的关注。其中一些特别令人感兴趣的治疗项目是SWI/SNF的家族成员。 染色质重塑了它们的复合体，大约20%的人类肺癌携带着一个新的亚单位突变。 复合体通常由三个核心部分组成：一个是ATPase重塑(SMARCA2)[BRM]或一个是SMARCA4(BRG1)。 蛋白质、蛋白质和其他四到八种辅助蛋白质(根据细胞类型的不同而不同)与基因组直接相关。 SWI/SNF复合体的ATPase结构域具有本土化特征，并具有催化活性。 已经在多项临床研究中被确定为治疗药物开发的合理靶点。然而，染色质。 重塑化验数据能够提高数据吞吐量，目前还缺乏筛查数据，这是EpiCypher将面临的一个主要问题。 通过这项新提案解决问题。我们将继续评估使用重组核小体技术(RNucs)的可行性。 在滑动的DNA序列上均质组装的DNA序列是一种高通量的、在生物学上具有相关性的基因。 筛选平台旨在进一步鉴定直接抑制染色质重塑的化合物。 EpiCypher将继续开发一种基于RNUC的新型核小体滑动检测技术，它将充分利用这一独特的技术。 DNA模板表明，在SWI/SNF将组蛋白八聚体重新定位以暴露大坝后，可以对其进行放射性标记。 甲基化位点基因(GATC)。在AIM 2中，我们将通过快速分析染色质来验证RNUC基因底物的快速滑动。 改良剂的活性与第一种分离的SMARCA4酶有关。在第二阶段，我们将继续专注于SMARCA4的商业化生产。 这是RNUC的高通量和不断下滑的筛选平台，为进一步识别主要的SWI/SNF靶标的药物抑制剂奠定了基础。 染色质重塑了他们的家庭。这是一个高度创新的医疗研究计划，将使治疗药物的开发成为可能。 对于染色质和重塑的复合体，这是一类主要的药物靶点，目前缺乏足够的药物筛查。 工具。

PROJECT SUMMARY  In  this  proposal,  EpiCypher  Inc.  will  develop  the  first  commercially  available  assay  to  monitor  nucleosome  remodeling,  a  major  current  focus  for  rational  drug  discovery  that  is  starved  of  HTS  tools.  Nucleosomes are the basic units of chromatin, made up of ~147 bp DNA tightly wrapped around an octamer of  histone  proteins.  Chromatin  remodeling  complexes  utilize  ATP  to  disrupt  DNA-­histone  interactions  and  reposition nucleosomes, thus regulating DNA access. Aberrant nucleosome organization can severely disrupt  gene expression, DNA repair and cellular differentiation, and is associated with cancer and disorders including  schizophrenia, chronic inflammation, and intellectual disability. The profound role of remodeling complexes in  tumorigenesis  and  cancer  progression  represents  a  new  target  class  for  epigenetic  drug  discovery  rapidly  gathering attention from our commercial partners. Of particular therapeutic interest are the SWI/SNF family of  chromatin  remodeling  complexes,  with  20%  of  all  human  cancers  harboring  a  subunit  mutation.  SWI/SNF  complexes  are  comprised  of  a  remodeling  ATPase  (SMARCA2  [BRM]  or  SMARCA4  [BRG1]),  three  core  proteins,  and  an  additional  four  to  eight  accessory  proteins  (varying  by  cell  type)  that  direct  genomic  localization  of  the  complex  and  stimulate  catalysis.  The  catalytic  ATPase  domains  of  SWI/SNF  complexes  have  been  identified  in  multiple  studies  as  rational  targets  for  therapeutic  development.  However,  chromatin  remodeling  assays  amenable  to  high  throughput  screening  are  currently  lacking,  a  problem  EpiCypher  will  address through this proposal. We will assess the feasibility of using recombinant nucleosomes (rNucs)  homogenously  assembled  on  sliding  DNA  sequences  as  a  high-­throughput,  biologically  relevant  screening  platform  to  identify  compounds  that  directly  inhibit  chromatin  remodeling.  In  Aim  1,  EpiCypher  will  develop  an  innovative  rNuc-­based  nucleosome  sliding  assay,  which  capitalizes  on  a  unique  DNA  template  that  can  be  radiolabeled  after  SWI/SNF  repositions  the  histone  octamer  to  expose  a  Dam  methylation  site  (GATC).  In  Aim  2,  we  will  validate  the  sliding  rNuc  substrates  by  assaying  chromatin  remodeler activity with the isolated SMARCA4 enzyme. In Phase II, we will focus on commercial production of  this high-­throughput sliding rNuc screening platform for the identification of inhibitors that target the SWI/SNF  chromatin  remodeling  family.  This  highly  innovative  research  program  will  enable  therapeutic  development  toward chromatin remodeling complexes, a major class of drug targets that currently lack adequate screening  tools.