A massively parallel reporter assay for measuring chromatin effects on alternative splicing

用于测量染色质对选择性剪接的影响的大规模并行报告分析

基本信息

  • 批准号:
    9977420
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 18.75万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    美国
  • 项目类别:
  • 财政年份:
    2020
  • 资助国家:
    美国
  • 起止时间:
    2020-05-11 至 2022-04-30
  • 项目状态:
    已结题

项目摘要

Tools for mapping transgene insertion sites and associated expression levels are broadly useful but current approaches are experimentally cumbersome and have limited throughput. Here, we propose to develop a novel type of reporter construct, genome reporter interprocessing (GRiP), that makes it dramatically easier to randomly integrate reporter genes in a large number of genomic locations and subsequently map the insertion site. We will apply GRiP technology to integrate a library of alternatively spliced reporter constructs into hundreds of thousands of different positions, thus enabling us to understand how alternative splice isoform ratios vary between different genomic contexts. We will use the resulting data to improve existing computational tools for predicting the impact of variants on alternative splicing. GRiP builds on existing technologies and pathways, most importantly CRISPR/Cas9 genome editing and transcript cleavage and polyadenylation (CPA). We will use a guide RNA (gRNA) library and Cas9 endonuclease activity to create double stranded breaks in a large but defined set of genomic locations. A linear reporter cassette will be co-transfected with the gRNA library and, at some frequency, will be ligated into the break through the non-homologous end joining pathway. The reporter cassette consists of, at least, a promoter, coding sequence and a truncated 3’UTR that ends directly at the core signal recruiting the CPA machinery. To perform insertion mapping, we take advantage of a key feature of CPA, namely the ~17 nucleotide (nt) distance between the core signal and the position of transcript cleavage and polyadenylation. Because the core signal of the reporter cassette will be directly ligated to genomic DNA, transcription will run through the end of the cassette and cleavage will occur ~17 nt into the neighboring genomic sequence. As a result, each transcript’s GRiP site will carry a ~17 nt “barcode” that reveals information about the site of integration. By sequencing the reporter transcripts and by combining the barcode information with information about the possible insertion sites (as determined by the chosen gRNAs), both location of insertion and transcriptional activity can be precisely mapped. While we here focus on initial technology development and on applying GRiP to investigate alternative splicing in the genome, we expect that this technology will find a wide range of additional applications including the precise mapping of double-stranded breaks generated during genome editing.
用于绘制转基因插入位点和相关表达水平的工具广泛有用,但目前 方法在实验上很麻烦并且吞吐量有限。在这里,我们建议开发一部小说 报告构建体的类型,基因组报告互处理(GRiP),这使得随机报告变得更加容易 将报告基因整合到大量基因组位置中,然后绘制插入位点图。我们 将应用 GRiP 技术将可变剪接报告构建体库集成到数百个 数千个不同的位置,从而使我们能够了解选择性剪接异构体比率如何变化 不同基因组背景之间。我们将使用所得数据来改进现有的计算工具 预测变异对选择性剪接的影响。 GRiP 建立在现有技术和途径的基础上, 最重要的是 CRISPR/Cas9 基因组编辑以及转录本切割和聚腺苷酸化 (CPA)。我们将使用 引导 RNA (gRNA) 文库和 Cas9 核酸内切酶活性,可在大但 定义的基因组位置集。线性报告盒将与 gRNA 文库共转染,并在 在某些频率下,会被连接成突破非同源末端的连接途径。记者 盒至少由启动子、编码序列和直接在核心终止的截短的 3'UTR 组成 发出招募注册会计师机制的信号。为了执行插入映射,我们利用了 CPA 的一个关键功能, 即核心信号与转录本切割位置之间的约 17 个核苷酸 (nt) 距离 聚腺苷酸化。由于报告盒的核心信号将直接连接至基因组DNA, 转录将贯穿盒的末端,并且将在约 17 nt 处切割到邻近的基因组中 顺序。因此,每个转录本的 GRiP 位点将携带约 17 nt 的“条形码”,该条形码揭示了以下信息: 整合的地点。通过对报告者转录本进行测序并将条形码信息与 有关可能插入位点的信息(由所选 gRNA 确定),两个插入位置 并且可以精确地绘制转录活性图。虽然我们在这里专注于初始技术开发和 在应用GRiP研究基因组中的选择性剪接时,我们预计这项技术将得到广泛的应用 一系列其他应用,包括精确映射过程中产生的双链断裂 基因组编辑。

项目成果

期刊论文数量(0)
专著数量(0)
科研奖励数量(0)
会议论文数量(0)
专利数量(0)

数据更新时间:{{ journalArticles.updateTime }}

{{ item.title }}
{{ item.translation_title }}
  • DOI:
    {{ item.doi }}
  • 发表时间:
    {{ item.publish_year }}
  • 期刊:
  • 影响因子:
    {{ item.factor }}
  • 作者:
    {{ item.authors }}
  • 通讯作者:
    {{ item.author }}

数据更新时间:{{ journalArticles.updateTime }}

{{ item.title }}
  • 作者:
    {{ item.author }}

数据更新时间:{{ monograph.updateTime }}

{{ item.title }}
  • 作者:
    {{ item.author }}

数据更新时间:{{ sciAawards.updateTime }}

{{ item.title }}
  • 作者:
    {{ item.author }}

数据更新时间:{{ conferencePapers.updateTime }}

{{ item.title }}
  • 作者:
    {{ item.author }}

数据更新时间:{{ patent.updateTime }}

Georg Seelig其他文献

Georg Seelig的其他文献

{{ item.title }}
{{ item.translation_title }}
  • DOI:
    {{ item.doi }}
  • 发表时间:
    {{ item.publish_year }}
  • 期刊:
  • 影响因子:
    {{ item.factor }}
  • 作者:
    {{ item.authors }}
  • 通讯作者:
    {{ item.author }}

{{ truncateString('Georg Seelig', 18)}}的其他基金

Engineering cell type-specific splicing regulation
工程细胞类型特异性剪接调控
  • 批准号:
    10633765
  • 财政年份:
    2023
  • 资助金额:
    $ 18.75万
  • 项目类别:
Joint receptor and protein expression immunophenotyping through split-pool barcoding
通过分池条形码进行联合受体和蛋白质表达免疫表型
  • 批准号:
    10625987
  • 财政年份:
    2021
  • 资助金额:
    $ 18.75万
  • 项目类别:
Joint receptor and protein expression immunophenotyping through split-pool barcoding
通过分池条形码进行联合受体和蛋白质表达免疫表型
  • 批准号:
    10375354
  • 财政年份:
    2021
  • 资助金额:
    $ 18.75万
  • 项目类别:
High-resolution spatial transcriptomics through light patterning
通过光图案化的高分辨率空间转录组学
  • 批准号:
    9886581
  • 财政年份:
    2020
  • 资助金额:
    $ 18.75万
  • 项目类别:
High-resolution spatial transcriptomics through light patterning
通过光图案化的高分辨率空间转录组学
  • 批准号:
    10341212
  • 财政年份:
    2020
  • 资助金额:
    $ 18.75万
  • 项目类别:
A massively parallel reporter assay for measuring chromatin effects on alternative splicing
用于测量染色质对选择性剪接的影响的大规模并行报告分析
  • 批准号:
    10161803
  • 财政年份:
    2020
  • 资助金额:
    $ 18.75万
  • 项目类别:
High-resolution spatial transcriptomics through light patterning
通过光图案化进行高分辨率空间转录组学
  • 批准号:
    10112854
  • 财政年份:
    2020
  • 资助金额:
    $ 18.75万
  • 项目类别:
A predictive model of mRNA stability and translation for variant interpretation and mRNA therapeutics
用于变异解释和 mRNA 治疗的 mRNA 稳定性和翻译的预测模型
  • 批准号:
    9894822
  • 财政年份:
    2018
  • 资助金额:
    $ 18.75万
  • 项目类别:
Predictive Modeling of Alternative Splicing and Polyadenylation from Millions of Random Sequences
数百万随机序列的选择性剪接和聚腺苷酸化的预测模型
  • 批准号:
    9306648
  • 财政年份:
    2017
  • 资助金额:
    $ 18.75万
  • 项目类别:

相似海外基金

Impact of alternative polyadenylation of 3'-untranslated regions in the PI3K/AKT cascade on microRNA
PI3K/AKT 级联中 3-非翻译区的替代多聚腺苷酸化对 microRNA 的影响
  • 批准号:
    573541-2022
  • 财政年份:
    2022
  • 资助金额:
    $ 18.75万
  • 项目类别:
    University Undergraduate Student Research Awards
How do untranslated regions of cannabinoid receptor type 1 mRNA determine receptor subcellular localisation and function?
1 型大麻素受体 mRNA 的非翻译区如何决定受体亚细胞定位和功能?
  • 批准号:
    2744317
  • 财政年份:
    2022
  • 资助金额:
    $ 18.75万
  • 项目类别:
    Studentship
MICA:Synthetic untranslated regions for direct delivery of therapeutic mRNAs
MICA:用于直接递送治疗性 mRNA 的合成非翻译区
  • 批准号:
    MR/V010948/1
  • 财政年份:
    2021
  • 资助金额:
    $ 18.75万
  • 项目类别:
    Research Grant
Translational Control by 5'-untranslated regions
5-非翻译区域的翻译控制
  • 批准号:
    10019570
  • 财政年份:
    2019
  • 资助金额:
    $ 18.75万
  • 项目类别:
Translational Control by 5'-untranslated regions
5-非翻译区域的翻译控制
  • 批准号:
    10223370
  • 财政年份:
    2019
  • 资助金额:
    $ 18.75万
  • 项目类别:
Translational Control by 5'-untranslated regions
5-非翻译区域的翻译控制
  • 批准号:
    10455108
  • 财政年份:
    2019
  • 资助金额:
    $ 18.75万
  • 项目类别:
Synergistic microRNA-binding sites, and 3' untranslated regions: a dialogue of silence
协同的 microRNA 结合位点和 3 非翻译区:沉默的对话
  • 批准号:
    255762
  • 财政年份:
    2012
  • 资助金额:
    $ 18.75万
  • 项目类别:
    Operating Grants
Analysis of long untranslated regions in Nipah virus genome
尼帕病毒基因组长非翻译区分析
  • 批准号:
    20790351
  • 财政年份:
    2008
  • 资助金额:
    $ 18.75万
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
Search for mRNA elements involved in the compatibility between 5' untranslated regions and coding regions in chloroplast translation
寻找参与叶绿体翻译中 5 非翻译区和编码区之间兼容性的 mRNA 元件
  • 批准号:
    19370021
  • 财政年份:
    2007
  • 资助金额:
    $ 18.75万
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
Post-transcriptional Regulation of PPAR-g Expression by 5'-Untranslated Regions
5-非翻译区对 PPAR-g 表达的转录后调控
  • 批准号:
    7131841
  • 财政年份:
    2006
  • 资助金额:
    $ 18.75万
  • 项目类别:
{{ showInfoDetail.title }}

作者:{{ showInfoDetail.author }}

知道了